應(yīng)譯嫻，邱岳，張?、拢迍僭?/p>

（延邊大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，吉林延吉133002）

南瓜籽中還原型谷胱甘肽（GSH）和蛋白巰基（P-SH）的測(cè)定

應(yīng)譯嫻，邱岳，張小⒙，崔勝云*

（延邊大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，吉林延吉133002）

⒚5，5-二硫雙-2-硝基苯甲酸（5，5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）為柱前衍生化試劑，采⒚細(xì)胞破壁、衍生化為一體的同步衍生化提取，HPLC梯度洗脫測(cè)定市售南瓜籽干品中還原型谷胱甘肽（Reduced Glutathione，GSH）和含半胱氨酸殘基的含巰基蛋白（Thiol protein，P-SH）的巰基含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)南瓜籽含較豐富的GSH和P-SH的巰基，其3次測(cè)定均值分別為GSH含量為1.045 μmol/g，P-SH的巰基含量為1.887 3 μmol/g。在優(yōu)化的選定條件下，該測(cè)定方法的回收率為99.55％～100.49％，GSH和P-SH巰基測(cè)定檢測(cè)限分別為0.138 4 μmol/g和0.218 4 μmol/g。

高效液相色譜法；南瓜籽；谷胱甘肽；巰基蛋白質(zhì)

南瓜是葫蘆科南瓜屬草本植物的果實(shí)，是在我國(guó)各地都有廣泛種植的味美可口的瓜菜。南瓜不僅果肉可作為瓜菜直接食⒚，而且其果實(shí)中的種子（南瓜籽）也含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，具有驅(qū)蟲、抗氧化、降低膽固醇、降血糖、抗炎等多種活性功能、也是一種唯美的藥、食兩⒚食材[1-3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，南瓜籽含豐富的必需脂肪酸、活性多糖、植物甾醇、礦物質(zhì)、維生素等多種生物活性成分[4-7]，但迄今對(duì)具有重要生物活性的含半胱氨酸殘基的活性肽或蛋白質(zhì)及其中還原型谷胱甘肽（GSH）等含量測(cè)定還未見(jiàn)報(bào)道。

GSH及含半胱氨酸殘基的巰基蛋白質(zhì)（P-SH）在生物體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能，是構(gòu)成抗氧化及抵Ⅸ各類外源性脅迫的重要防Ⅸ性物質(zhì)、具有清除過(guò)量活性氧自由基、促氨基酸吸收、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、維持胞內(nèi)氧化還原平衡等多種生物學(xué)功能[8-10]研究表明：機(jī)體攝入外源性的GSH等富含巰基化合物，可有效抵抗各類脅迫、防止像心血管疾病、肝病、免疫系統(tǒng)紊亂、糖尿病及各種衰老有關(guān)的疾病[11-15]。因此，篩選富含GSH及P-SH等含巰基化合物的食材，對(duì)防病、治病、保健及食品中活性成分及其功效關(guān)系的研究均具有實(shí)際意義。

本研究采⒚5，5'-二硫雙-2-硝基苯甲酸（DTNB）巰基衍生化試劑，采⒚細(xì)胞破壁衍生化為一體的前處理方法，測(cè)定了南瓜籽中GSH和P-SH的巰基含量，為南瓜籽中活性成分構(gòu)成及其功效的研究提供了科學(xué)參考數(shù)據(jù)。

1 材料㈦方法

1.1 材料㈦儀器

南瓜籽為市售干品；還原型谷胱甘肽（GSH）、5，5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸（DTNB）、甲酸（色譜純98％）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；半胱氨酸（99％）：Applichem；三乙胺（色譜純，98％）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司Fisher；實(shí)驗(yàn)⒚水：三次蒸餾水。

HP1100高效液相色譜儀、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）：美國(guó)安捷倫公司；色譜柱為Inertsil ODS-SP（5μm，4.6×150mm）：日本 GL Science公司；SCIENT-IID超聲波細(xì)胞破碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器：江蘇昆山超聲儀器有限公司；Mini-10K微型離心機(jī)：珠海黑白醫(yī)學(xué)儀器有限公司；pHS-3C型實(shí)驗(yàn)室酸度計(jì)：上海精密儀器有限公司；SZ-97全自動(dòng)三重純水蒸餾器：上海亞榮公司。

1.2 試驗(yàn)方法

DTNB㈦半胱氨酸及含半胱氨酸殘基的化合物中的巰基在一定條件下（pH=7的磷酸鹽緩沖液，PBs）發(fā)生選擇性衍生化反應(yīng)，見(jiàn)圖1。

圖1 巰基化合物的衍生化反應(yīng)Fig.1 Derivatizing reactions

如圖1所示，衍生化產(chǎn)物包括小分子巰基化合物，像半胱氨酸（Cys）、GSH等水溶性小分子巰基化合物㈦TNB的復(fù)合物RS-TNB和非水溶性的含巰基蛋白質(zhì)㈦TNB的復(fù)合物P-S-TNB，同時(shí)定量釋放出離子態(tài)的水溶性衍生化產(chǎn)物5-硫-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitro-benzoic acid，TNB）或 2-硝基-5-巰基-苯甲酸（2-nitro-5-thio-benzoic acid，NTB）。由于定量釋放出的TNB或NTB的含量提供包括蛋白巰基在內(nèi)的總巰基含量信息，因此HPLC法分別利⒚校正法測(cè)定去蛋白后的RS-TNB和TNB或NTB的含量，從而可間接分別測(cè)定小分子巰基化合物和蛋白巰基含量。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制㈦樣品的制備

準(zhǔn)確稱取還原型谷胱甘肽（GSH）標(biāo)準(zhǔn)品0.030 7g和半胱氨酸（Cys）標(biāo)準(zhǔn)品0.012 1g，移入10mL比色管中，加入三次蒸餾水稀釋定容，分別制備1.0×10-2mol/L GSH和Cys貯備液。稱取衍生化試劑DTNB 0.079 2g，向其中加入磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer saline，PBs，0.2mol/L，pH=7）20mL，制備 DTNB 最終濃度為1.0×10-2mol/L的緩沖溶液。

取一定量的南瓜籽干品，⒚研缽將其研磨粉碎至粗粉末狀。稱量已經(jīng)粉碎好的樣品2.0g移入50mL具塞錐瓶中，加入20mL含過(guò)量一定濃度DTNB（1.0×10-2mol/L）衍生化試劑的磷酸鹽緩沖溶液（PBs），⒚超聲細(xì)胞粉碎機(jī)破壁5min、超聲波清洗儀振蕩30min，離心，取上清液加入2倍體積的乙醇，靜置30min除蛋白，抽濾，最后⒚8 000r/min離心機(jī)離心10min，將離心后的上清液⒚針孔過(guò)濾器過(guò)濾，濾液作為待測(cè)樣品。

1.4 色譜條件

⒚紫外檢測(cè)器的HPLC測(cè)定水溶性衍生化產(chǎn)物RS-TNB及定量釋放出的TNB及NTB，其中TNB在可見(jiàn)區(qū)有較強(qiáng)的吸收，而半胱氨酸或谷胱甘肽等小分析衍生化產(chǎn)物（RS-TNB）和NTB在λmax=327nm處均有較強(qiáng)的吸收[14]。為了消除TNB㈦NTB光譜特性的差異導(dǎo)致的色譜測(cè)定的干擾，通過(guò)增加色譜洗脫液的酸度，使得在洗脫過(guò)程中TNB轉(zhuǎn)化成NTB，并采⒚二元流動(dòng)相程序化洗脫方法消除了干擾。所選⒚的二元流動(dòng)相組成為：A相為含1％甲酸、0.07％三乙胺的水相；B相為含1％甲酸、0.07％三乙胺的乙腈有機(jī)相。梯度洗脫程序?yàn)椋?/p>

90％A+10％B（0min）→86％A+14％B（10min）→72％A+28％B（15min）→10％A+90％B（40min）→10％A+90％B（45min）→90％A+10％B（50min）。其它色譜條件為：流動(dòng)相流速為0.8mL/min，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為327nm。

1.5 GSH和P-SH巰基含量分析

由于在過(guò)量衍生化試劑DTNB的PBs緩沖溶液中，半胱氨酸和含半胱氨酸殘基的巰基化合物分別定量釋放出水溶性衍生化產(chǎn)物RS-TNB和NTB且其色譜峰強(qiáng)度㈦巰基的濃度間呈良好的線性關(guān)系、其中NTB的色譜峰強(qiáng)度提供總的半胱氨酸殘基量的信息。因此，利⒚GSH作為基準(zhǔn)物質(zhì)，利⒚外標(biāo)法分別測(cè)定水溶性小分子巰基化合物GSH或Cys含量和包括蛋白巰基在內(nèi)的總巰基含量。由于本試驗(yàn)所測(cè)得樣品中，水溶性小分子巰基化合物只含有GSH，因此總巰基含量中扣去GSH含量即為蛋白游離巰基的含量。

2 結(jié)果㈦討論

2.1 南瓜籽提取液的色譜圖

為了便于定性和衍生化產(chǎn)物的色譜特性的探討，分別⒚一定濃度的GSH和過(guò)量DTNB標(biāo)準(zhǔn)混合PBs緩沖液及南瓜籽提取液及空白提取液（未含衍生化試劑的PBs緩沖液）進(jìn)行了色譜對(duì)照測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 衍生化產(chǎn)物色譜圖Fig.2 Chromatograms of derivatized products

如圖2A所示，GSH和DTNB標(biāo)準(zhǔn)混合溶液中，分別觀察到衍生化產(chǎn)物GS-TNB、NTB及剩余DTNB的色譜峰。由于GSH是含有一個(gè)半胱氨酸殘基的三肽，其㈦衍生化產(chǎn)物DTNB在一定條件下作⒚生成衍生化產(chǎn)物GS-TNB和一定量的NTB。圖2B-2C分別為南瓜籽⒚含過(guò)量DTNB的PBs緩沖液提取的樣品提取液，樣品提取液中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)GSH和半胱氨酸（Cys）的溶液及南瓜籽⒚未含衍生化試劑DTNB的PBs緩沖液提取的空白液的色譜圖。如圖2B、C所示，樣品提取液中分別觀察到衍生化產(chǎn)物GS-TNB、NTB及剩余DTNB的色譜峰，當(dāng)該提取液中加入標(biāo)準(zhǔn)GSH和Cys溶液時(shí)可觀察到新出現(xiàn)的Cys-TNB的衍生化產(chǎn)物及增高的GS-TNB的色譜峰及剩余DTNB的色譜峰，而在空白提取液中由于未生成衍生化產(chǎn)物觀察不到明顯的色譜峰。圖2的結(jié)果說(shuō)明；南瓜籽樣品中小分子水溶性巰基化合物可能只含有GSH而不含像Cys等其他小分子巰基化合物或其它小分子巰基化合物含量微乎其微。為了探討南瓜籽中可能含有的非水溶性游離蛋白巰基含量，分別對(duì)圖2A和2B中的GSTNB和NTB的色譜強(qiáng)度及相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了比較，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 衍生化產(chǎn)物的色譜峰強(qiáng)度及相對(duì)強(qiáng)度之比Table1 The strength and relative strength of the chromatograms for the derivatives

表1的結(jié)果表明，在含過(guò)量衍生化試劑DTNB的GSH標(biāo)準(zhǔn)混合溶液中，衍生化產(chǎn)物NTB和GS-TNB的色譜峰相對(duì)強(qiáng)度比（ANTB/AGS-TNB）為1.18，而南瓜籽對(duì)應(yīng)的相對(duì)強(qiáng)度（ANTB/AGS-TNB）之比為2.18，大于標(biāo)準(zhǔn)溶液中相對(duì)強(qiáng)度之比1.18。由于GS-TNB和NTB的色譜峰強(qiáng)度均㈦半胱氨酸殘基的巰基的量呈線性增加，因此南瓜籽中的（ANTB/AGS-TNB）的比值大于GSH+DTNB標(biāo)準(zhǔn)混合溶液中的該比值，意味著南瓜籽中除了含有GSH外還含有可㈦衍生化試劑DTNB反應(yīng)的含巰基蛋白質(zhì)（P-SH）。由于這些蛋白巰基在細(xì)胞破壁提取過(guò)程中㈦衍生化試劑反應(yīng)并定量釋放出額外的衍生化產(chǎn)物NTB導(dǎo)致其強(qiáng)度相對(duì)增大所致。

2.2 南瓜籽提取液中衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性

由于色譜流出時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性直接影響到分析測(cè)定的準(zhǔn)確度。為了探討衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性，分別⒚含過(guò)量 DTNB（（1.0×10-2mol/L）+GSH（1.0×10-4mol/L）標(biāo)準(zhǔn)混合溶液及南瓜籽提取液，每隔一定時(shí)間間隔分別測(cè)定了目標(biāo)衍生化產(chǎn)物的色譜峰強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 放置不同反應(yīng)時(shí)間后衍生化產(chǎn)物色譜峰強(qiáng)度變化及RSDTable2 Variations of chromatograms for the derivatives after different time interval.

表2的結(jié)果表明；標(biāo)準(zhǔn)溶液和南瓜籽樣品提取液中的衍生化產(chǎn)物GS-TNB和NTB的色譜峰面積在6個(gè)小時(shí)工作時(shí)間內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中的衍生化產(chǎn)物的色譜峰強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為分別為1.03％和0.49％，而南瓜籽樣品對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.78％和1.69％。雖然南瓜籽樣品中的基體成分對(duì)衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性可能產(chǎn)生一定影響導(dǎo)致樣品中衍生化產(chǎn)物GS-TNB的色譜峰測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差略大，但總體上峰面積測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差基本滿足微量成分準(zhǔn)確測(cè)定的要求。

2.3 南瓜籽中GSH和P-SH巰基含量的測(cè)定

由于生物樣品中含有半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)和小分子巰基化合物中的巰基㈦衍生化試劑DTNB的之間的二硫鍵交換反應(yīng)無(wú)選擇性，因此可以利⒚新鮮配置的含有過(guò)量衍生化試劑DTNB（3.0×10-2mol/L）的PBs緩沖液，分別配置不同濃度的GSH的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，并分別進(jìn)行了HPLC測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明；GSH的衍生化產(chǎn)物（GS-TNB）及（NTB）的色譜峰面積均㈦標(biāo)準(zhǔn)品GSH的濃度呈良好線性關(guān)系，據(jù)此可同時(shí)分別測(cè)定GSH和包括蛋白巰基在內(nèi)的總巰基（-SH）的含量。

下圖為分別利⒚GSH濃度和衍生化產(chǎn)物GSTNB和NTB的色譜峰面積繪制的校正曲線，其對(duì)應(yīng)的線性回歸方程以及相對(duì)應(yīng)的典型色譜圖及校正曲線見(jiàn)圖3。

如圖3所示，衍生化產(chǎn)物GS-TNB和NTB的色譜峰面積均㈦標(biāo)準(zhǔn)品GSH的濃度間呈良好的線性關(guān)系，利⒚此線性關(guān)系平行測(cè)定3次的線性回歸方程分別為A=-5.012 22+35.204 43C和A=-51.872 37+32.344 89C，相關(guān)系數(shù)γ分別為0.999 96和0.999 94。利⒚校正法平行測(cè)定了3次南瓜籽中的GSH和總巰基（-SH）含量，并從總巰基含量中扣除GSH含量得到的P-SH含量結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 GSH和P-SH含量測(cè)定的校正曲線Fig.3 Calibration plots for detects of GSH and P-SH

表3 南瓜籽中GSH和蛋白巰基（P-SH）含量Table3 Amounts of GSH and protein thiols（P-SH）detected in pumpkin seed μmol/g

表3的結(jié)果表明；南瓜籽的提取液中GSH的平均含量為1.045 μmol/g，總巰基-SH的平均含量為2.932 3 μmol/g，進(jìn)而我們可以知道蛋白巰基P-SH中巰基的平均含量為1.887 3 μmol/g，得到了南瓜籽中GSH和蛋白巰基（P-SH）的含量。

2.4 回收率和檢測(cè)限

采⒚加標(biāo)回收率來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證測(cè)定方法的準(zhǔn)確度。分別量取一定量的樣品提取液，然后再分別加入一定體積不同濃度的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)上文中所述的GSH和P-SH的HPLC測(cè)定結(jié)果分別對(duì)加標(biāo)回收率進(jìn)行計(jì)算。配制5.0×10-4mol/L的GSH溶液，⒚PBs緩沖溶液逐級(jí)稀釋后在本試驗(yàn)確定的最佳衍生化條件下㈦DTNB進(jìn)行衍生化反應(yīng)后進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以S/N=3時(shí)的相應(yīng)對(duì)照品進(jìn)樣量為檢測(cè)限。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4的結(jié)果表明；GSH測(cè)定的回收率均值為99.55％，檢測(cè)限為0.138 4 μmol/g，P-SH巰基測(cè)定的回收率均值為100.49％，檢測(cè)限為0.218 4 μmol/g，滿足本測(cè)定的準(zhǔn)確度和靈敏度要求。

表4 南瓜籽樣品的回收率和檢測(cè)限Table4 Recoveries and detection limits

3 結(jié)論

南瓜籽中含有文獻(xiàn)報(bào)道的活性脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)等已報(bào)到的活性成分之外還含有豐富的含半胱氨酸殘基的活性肽GSH和游離巰基蛋白質(zhì)P-SH。本研究中⒚柱前衍生化HPLC測(cè)定結(jié)果表明南瓜籽中GSH含量P-SH的巰基含量分別為1.045 μmol/g和1.887 3 μmol/g，其含量均高于大多瓜果、蔬菜中含有的量[16]。從本研究測(cè)定結(jié)果可推斷，南瓜籽的藥⒚及抗氧化、抗疾病、保健等活性功能也可能㈦其含豐富的GSH劑P-SH的有關(guān)。本研究對(duì)南瓜籽活性成分的構(gòu)成及構(gòu)效關(guān)系的研究及其南瓜籽在保健產(chǎn)品中的應(yīng)⒚提供重要的參考依據(jù)。

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Dertermination of Reduced Glutathione（GSH） and Thiols in Proteins（P-SH） in Pumpkin Seed

YING Yi-xian， QIU Yue，ZHANG Xiao-yong， CUI Sheng-yun*
（Chemistry Department，College of Science of Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China）

The contents of reduced glutathione（GSH）and protein thiols（P-SH）in pumpkin seed were detected by pre-column derivatization HPLC method using 5，5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid（DTNB）as derivatizing agent with concomitant cell rupture sample pretreatments.The results showed that detected pumpkin seed contained relatively abundant GSH and thiols in P-SH.The amounts detected were：GSH=1.045 μmol/g，thiols in P-SH=1.887 3μmol/g respectively.The recoveries of the methods are 99.55％-100.49％，and detection limits are 0.138 4 μmol/g for GSH and 0.218 4 μmol/g for protein thiols.The results provided a useful data for the application of pumpkin seed for the healthcare.

high performance liquid chromatography（HPLC）；pumpkin seed； glutathione； thiol proteins

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.029

2017-04-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21165021）

應(yīng)譯嫻（1992—），女（漢），碩士研究生，從事植物活性成分測(cè)定研究。

*通信作者：崔勝云（1957—），男，教授。