李曉喆，賴新生

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405）

針刺太沖穴對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠小腦差異蛋白表達(dá)的影響

李曉喆，賴新生*

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405）

目的 探討針刺太沖穴對(duì)自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠小腦差異蛋白表達(dá)的影響。方法 選用SHR大鼠55只，隨機(jī)分為模型組、非穴組、曲泉組、太沖組、沖陽(yáng)組5組，每組11只；另取Wistar大鼠8只，作為正常組。模型組和正常組只抓取不針刺，其余4組相應(yīng)針刺曲泉穴、太沖穴、非穴和沖陽(yáng)穴，1次/d，共7 d，記錄實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠的血壓變化，后將小鼠處死取材，獲得小腦組織，通過(guò)雙向電泳和質(zhì)譜檢測(cè)觀察蛋白表達(dá)結(jié)果。結(jié)果 治療前后血壓對(duì)比模型組的血壓有顯著升高（P＜0.05），太沖組舒張壓呈下降趨勢(shì)，其他針刺組的收縮壓和舒張壓有略微升高，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；雙向電泳和質(zhì)譜結(jié)果顯示太沖穴組針刺后小腦區(qū)蛋白表達(dá)點(diǎn)上調(diào)明顯多于曲泉組、沖陽(yáng)組及非穴組。結(jié)論 針刺太沖穴后促使小腦組織蛋白表達(dá)發(fā)生差異性變化，其差異蛋白點(diǎn)功能包括促進(jìn)代謝產(chǎn)物如過(guò)氧化物的消除、加快遺傳信息轉(zhuǎn)化、促進(jìn)神經(jīng)再生等，為神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫網(wǎng)絡(luò)假說(shuō)提供佐證。

穴，太沖；SHR；小腦；蛋白表達(dá)

高血壓是臨床中最常見(jiàn)的一種慢性疾病，是心腦血管疾病中最為主要的危險(xiǎn)因素之一。當(dāng)前我國(guó)的患高血壓病的患者數(shù)量增加迅速，甚至仍然呈現(xiàn)增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)[1-3]。針灸作為一種非藥物療法在治療高血壓上也發(fā)揮著顯著的療效，其降壓機(jī)制尚不明確，筆者通過(guò)研究針刺太沖穴在自發(fā)性高血壓大鼠小腦差異蛋白的表達(dá)，探究經(jīng)穴治療效應(yīng)的特異性，并為神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫網(wǎng)絡(luò)假說(shuō)提供佐證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF級(jí)9周齡雄性Wistar大鼠8只，大鼠體質(zhì)量范圍180～200 g（由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)11400700086589），SPF級(jí)9周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠55只，大鼠體質(zhì)量范圍180～200 g（由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)114007000865901）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室專人飼養(yǎng)管理，控制動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度，保持在20～25 ℃，濕度保持在60%～80%，每日定時(shí)進(jìn)行通風(fēng)，避免噪音強(qiáng)光。

1.2 儀器與試劑 環(huán)球牌7 mm×0.30 mm無(wú)菌針灸針；無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)，ALC-NIBP（上海奧爾科特生物科技有限公司）；手術(shù)刀；鑷子；1.5 mLEP管；移液器；去離子水；分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司 Spectrum SHANHAI 765Pc）；胎牛血清標(biāo)準(zhǔn)品BSA（濃度為5 μg/μL）（Sigma）；Bradford染液(595 nm)；甲醇（清洗比色皿）；二硫蘇糖醇DTT (GE)；IPG Buffer（pH4-7) (GE)；溴酚藍(lán)Bromophenol blue solution（300× BPB）；再水化液 RB；冷凍離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司Hema medical instrument Co.， LTDHema TGL-18R)；水平搖床；染色盤；燒杯；量筒；移液器(1 000 μL)；磁力攪拌器；計(jì)時(shí)器；掃描儀(UMAX Powerlook1100)；美國(guó)ABI4800 MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀等。

1.3 方法

1.3.1 分組與血壓的測(cè)量 使用隨機(jī)數(shù)字表法將SHR大鼠隨機(jī)分為模型組、非穴組、曲泉組、太沖組、沖陽(yáng)組5組，每組11只，另取8只Wistar大鼠作為正常對(duì)照組。各組大鼠在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，使用無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)記錄治療前的血壓，模型組和正常對(duì)照組只抓取不針刺，其余4組相應(yīng)針刺曲泉穴、太沖穴、非穴和沖陽(yáng)穴，1次/d，共7 d，再次測(cè)量實(shí)驗(yàn)后各組小鼠的血壓變化。

1.3.2 取材 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后開(kāi)胸、充分暴露大鼠心臟，剪開(kāi)右心耳，開(kāi)放靜脈血，從左心室注入50～100 mL 4 ℃冰生理鹽水，以流出血液變白及心臟顏色變淺為度。緊貼枕骨下緣斷頭，除去枕后肌肉，用彎嵌仔細(xì)剔除顱骨，取腦。在冰塊上，用手術(shù)刀切除小腦，迅速放入試管內(nèi)，-80 ℃保存。在研缽中倒入液氮預(yù)冷，然后將大塊的組織切細(xì)后置于研缽中，迅速加入液氮。加入400 μL 裂解液，充分溶解（收集）粉末后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中。超聲處理后放于冰上冷卻，破碎核酸，4 ℃，12 000 r/min，離心20 min，收集上清液，加入1 mL丙酮-20 ℃沉淀過(guò)夜。沉淀完的蛋白質(zhì)于4 ℃，12 000 r/min，離心20 min，倒去上清液，打開(kāi)管蓋平放于干凈的紙巾上自然干燥，即可得到處理后的蛋白質(zhì)團(tuán)塊。

1.3.3 雙向電泳及質(zhì)譜檢測(cè) 二向電泳的程序?yàn)椋篠1 2 W/gel 45 min、S2 17 W/gel 直到溴酚藍(lán)跑到底。利用美國(guó)ABI4800 MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，UV波長(zhǎng)為355 nm，重復(fù)速率為200 HZ，加速電壓為20 000 V，最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1 500 Da；掃描質(zhì)量范圍為700～3 200 Da，收集信號(hào)；胰酶自切峰為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜儀；所有實(shí)驗(yàn)樣品的質(zhì)譜圖均以用默認(rèn)模式獲得。

2 結(jié)果

2.1 各組血壓變化 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠治療前后血壓對(duì)比(x±s ，n=11) mmHg

2.2 各組蛋白點(diǎn)表達(dá)差異比較 見(jiàn)表2。

表2 各組蛋白點(diǎn)表達(dá)的差異比較

2.3 質(zhì)譜檢測(cè) 利用美國(guó)ABI4800 MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，根據(jù)結(jié)果搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，共鑒定出36個(gè)差異斑點(diǎn)蛋白。

2.3.1 Wistar組與模型組的組間比較 見(jiàn)表3，表4。

表3 Wistar組小腦區(qū)表達(dá)上調(diào)蛋白鑒定結(jié)果

2.3.2 曲泉組與模型組的組間比較 曲泉組小腦區(qū)表達(dá)上調(diào)蛋白鑒定結(jié)果：檢測(cè)出1個(gè)蛋白點(diǎn)，C02(Protein Sf3a3)。曲泉組小腦區(qū)表達(dá)下調(diào)蛋白鑒定結(jié)果：檢測(cè)出1個(gè)蛋白點(diǎn)，D01(突觸結(jié)合蛋白)。

2.3.3 太沖組與模型組的組間比較 太沖組小腦區(qū)表達(dá)上調(diào)蛋白鑒定結(jié)果：共8個(gè)蛋白點(diǎn)，分別為F14、F15、F18、F23、F28、F33、F35、F47。F14(核糖核蛋白)、F15(Protein Tom1l2)、F18(Protein Usp14)、F23(V型質(zhì)子ATP酶亞基B，腦亞型)、F28(Protein Sept4)、F33(膜聯(lián)蛋白)、F35(轉(zhuǎn)錄激活蛋白-α[片段])、F47(過(guò)氧化物酶)。太沖組小腦區(qū)表達(dá)下調(diào)蛋白鑒定結(jié)果：共3個(gè)蛋白點(diǎn)，分別為E20、E31、E43。E20(鈣網(wǎng)蛋白)、E31(Protein Setd7)、E43(Hsp90 co-chaperone Cdc37)。

表4 模型組小腦區(qū)表達(dá)上調(diào)蛋白鑒定結(jié)果

2.3.4 非穴組與模型組的組間比較 非穴組小腦區(qū)表達(dá)上調(diào)蛋白鑒定結(jié)果：共1個(gè)蛋白點(diǎn)，H01(Thimet寡肽)。非穴組小腦區(qū)表達(dá)下調(diào)蛋白鑒定結(jié)果：共4個(gè)蛋白點(diǎn)，分別為G10、G11、G24、G39。G10(Group specifc component)、G11(神經(jīng)絲蛋白輕鏈多肽)、G24(蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基7)、G39(Uncharacterized protein)。

2.3.5 沖陽(yáng)組與模型組的組間比較 沖陽(yáng)組小腦區(qū)表達(dá)上調(diào)蛋白鑒定結(jié)果：共1個(gè)蛋白點(diǎn)，J01(Thimet寡肽)；沖陽(yáng)組小腦區(qū)表達(dá)下調(diào)蛋白鑒定結(jié)果：共2個(gè)蛋白點(diǎn)，分別為I09、I31。I09(Endophilin-B2)、I31(血影蛋白α鏈，非紅細(xì)胞1)。

3 討論

通過(guò)觀察各組大鼠治療前后血壓變化發(fā)現(xiàn)在短時(shí)間內(nèi)（7 d）針刺對(duì)SHR大鼠的血壓沒(méi)有明顯的改善作用，但是太沖組治療后舒張壓呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)而其余各組均出現(xiàn)上升趨勢(shì)，這說(shuō)明針刺太沖的降壓作用可能體現(xiàn)在改善大鼠的舒張壓。

近年來(lái)很多學(xué)者[5-13]在研究針刺太沖治療高血壓，并推測(cè)針刺太沖穴的降壓機(jī)制可能與降低SHR大鼠血漿內(nèi)皮素和升高血清一氧化氮的含量有關(guān)。通過(guò)觀察蛋白點(diǎn)表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)針刺太沖后大鼠小腦內(nèi)蛋白點(diǎn)表達(dá)差異與其他組均呈現(xiàn)出明顯的差異。

與自發(fā)性高血壓大鼠相比，正常大鼠A01、A02、A10、A12、A21、A22、A23蛋白表達(dá)較為活躍，其中胞漿10 -甲酰脫氫酶有利于調(diào)節(jié)遺傳信息代謝、抗腫瘤細(xì)胞增生；單向復(fù)合物Mic60與線粒體能量代謝相關(guān)且起正向作用；蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3催化蛋白構(gòu)想，協(xié)同參與免疫應(yīng)答。在未患病的正常大鼠中，促進(jìn)代謝與加強(qiáng)免疫的酶的分泌明顯多于SHR模型組，提示除了血壓差異外，SHR大鼠的神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)也發(fā)生了功能失常。

太沖組針刺后表達(dá)上調(diào)的蛋白中，核糖核蛋白影響mRNA的前處理和mRNA代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的其他方面；V型質(zhì)子ATP酶亞基B，腦型；為液泡ATP酶外周V1復(fù)合物的非催化亞基。V-ATP酶負(fù)責(zé)酸化多種在真核細(xì)胞胞內(nèi)隔室；膜聯(lián)蛋白A7，鈣-磷脂結(jié)合蛋白，功能為促進(jìn)膜融合，并參與胞吐過(guò)程；轉(zhuǎn)錄激活蛋白- α（片段），在DNA復(fù)制的開(kāi)始和重組過(guò)程中可以發(fā)揮作用；過(guò)氧化物酶-2，參與細(xì)胞的氧化還原調(diào)節(jié)過(guò)程，在消除代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化物時(shí)，該酶起到了重要作用。通過(guò)調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫的細(xì)胞內(nèi)濃度，進(jìn)而參與生長(zhǎng)因子和腫瘤壞死因子- α的信號(hào)級(jí)聯(lián)。此組蛋白酶協(xié)同增強(qiáng)腦組織的代謝，促進(jìn)神經(jīng)組織增生，或可為改善腦組織微環(huán)境提供依據(jù)。通過(guò)神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)來(lái)改善大鼠的舒張壓[14-18]。

綜上，針刺太沖穴后促使小腦組織蛋白表達(dá)發(fā)生差異性變化，其差異蛋白點(diǎn)功能包括促進(jìn)代謝產(chǎn)物如過(guò)氧化物的消除、加快遺傳信息轉(zhuǎn)化、促進(jìn)神經(jīng)再生等，能夠?yàn)樯窠?jīng)－內(nèi)分泌－免疫網(wǎng)絡(luò)假說(shuō)提供了佐證。

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Study on the expression of acupuncture Taichong in spontaneously hypertensive ratscerebellar proteins

LI Xiaozhe, LAI Xinsheng*
(Acupuncture Rehabilitation Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China )

Point, Taichong (LR 3); SHR; cerebellum; protein expression

245.3

A

2095-6258(2017)04-0526-04

2016-05-08）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.04.004

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173349）。

李曉喆（1987 -），女，博士研究生，主要從事針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)研究。

*通信作者：賴新生，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，電子信箱-lai1023@163.com

Abstract: Objective To explore the effects on the expression of acupuncture Taichong in spontaneously hypertensive rats cerebellar proteins. Methods 55 SHR rats were randomly divided into model group, non acupoint group, Ququan group, Taichong group, Chongyang group, each group of 11 only. The other 8 Wistar rats as normal group.The model group and the normal group without acupuncture, the other 4 groups corresponding acupuncture Ququan acupoint and non acupoint, Taichong, Chong Yang points, 1 /d, 7 d. Record the blood pressure changes before and after the experiment of mice. Then the mice were sacrifced to obtain cerebellar tissue, results by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry detection to observe the protein expression. Results Blood pressure before and after treatment comparison results show that the model group's blood pressure increased signifcantly (P＜0.05), diastolic blood pressure decreased in A group, systolic and diastolic blood pressure in other acupuncture group is slightly higher, but they had no statistical significance (P＞0.05); Two dimensional electrophoresis and mass spectrometry showed thatcerebellar protein expression increases signifcantly more than Ququan group, Chongyang group and non acupoint groupafter acupuncture at Taichong group. Conclusion The cerebellar tissue protein expression difference after acupuncture at Taichong, the difference in protein functions including promoting metabolites such as peroxide elimination, accelerate the conversion of genetic information, promote nerve regeneration etc.This provides the hypothesis of evidence for the nerve-endocrine-immune network.