殷丹婷,郝麗鑫,王 琦,趙新淮

(乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,東北農(nóng)業(yè)大學(xué),黑龍江哈爾濱 150030)

山藥多糖和燕麥多糖發(fā)酵產(chǎn)酸及發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用

殷丹婷,郝麗鑫,王 琦,趙新淮*

(乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,東北農(nóng)業(yè)大學(xué),黑龍江哈爾濱 150030)

采用水提取、醇沉淀法制備山藥多糖和燕麥多糖,利用健康成人糞便提取物中的腸道微生物體外發(fā)酵多糖,確定發(fā)酵產(chǎn)酸情況(乙酸，丙酸，丁酸，乳酸)以及發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的增殖抑制作用。山藥多糖和燕麥多糖的糖含量分別為82.63%和80.32%。發(fā)酵24 h,山藥多糖和燕麥多糖產(chǎn)生23.28、25.14 mmol/L乙酸、2.49、1.97 mmol/L丙酸、11.04、7.99 mmol/L丁酸和0.19、0.46 mmol/L乳酸;發(fā)酵48 h,它們產(chǎn)生四種酸為28.14、42.53，6.48、2.45，13.76、9.64，0.08、0.09 mmol/L。發(fā)酵時(shí)間從24 h延長(zhǎng)至48 h,產(chǎn)物中乙酸、丙酸和丁酸含量顯著提高(p<0.05),而乳酸含量明顯降低(p<0.05)。兩種多糖對(duì)細(xì)胞的抑制作用小于24.5%,而兩種多糖發(fā)酵產(chǎn)物有更強(qiáng)的抑制作用,分別達(dá)到46.2%～69.1%、44.6%～67.3%;48 h發(fā)酵產(chǎn)物抑制作用更強(qiáng),處理細(xì)胞48 h產(chǎn)生的抑制作用更大。結(jié)果表明,兩種多糖經(jīng)過(guò)腸道微生物發(fā)酵后,其產(chǎn)物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖抑制活性。

山藥多糖,燕麥多糖,發(fā)酵,短鏈脂肪酸,結(jié)腸癌細(xì)胞

在植物性食品中,天然植物多糖被認(rèn)為是一種最重要的成分[1]。植物多糖是相對(duì)復(fù)雜的碳水化合物,也是最豐富的有機(jī)化合物[2]。研究表明,一些非消化性植物多糖具有各種各樣的生物活性,例如免疫調(diào)節(jié)作用[3-5]、抗腫瘤[6-7]、降血糖[8]、降血脂[9]、抗病毒[10]、抗衰老[11]、抗氧化[12]等。這些多糖備受關(guān)注,對(duì)其提取、純化以及生物活性的研究頗多,例如山藥多糖和燕麥多糖[13-14]。水提取、醇沉淀法是最常見(jiàn)的多糖制備方法[13]。非消化性多糖在體內(nèi)不吸收,但是可以被腸道微生物發(fā)酵[15-16]?？剐缘矸?、非淀粉多糖和非消化性低聚糖等被腸道微生物發(fā)酵后,產(chǎn)生各種短鏈脂肪酸主要包括乙酸、丙酸和丁酸等[17]。短鏈脂肪酸對(duì)機(jī)體健康有益,因?yàn)樗鼈兛梢越档湍c內(nèi)環(huán)境pH,抑制有害菌的生長(zhǎng),防止腸道功能紊亂[18]。此外,短鏈脂肪酸還有其他方面的健康作用。例如,乙酸和丙酸可以影響血脂和膽固醇的代謝,有降低血脂和膽固醇的作用[19-20]。又如,丁酸可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡,具有抗癌作用[21-23]。

山藥和燕麥?zhǔn)侵匾氖巢?其組成成分包括多糖。進(jìn)食山藥和燕麥后,山藥多糖和燕麥多糖將進(jìn)入消化道、并被腸道微生物所發(fā)酵。但是,山藥多糖和燕麥多糖發(fā)酵后是否會(huì)影響抗結(jié)腸癌作用,目前尚缺乏必要的體外、體內(nèi)評(píng)估。因此,本研究采用水提取、醇沉淀法提取山藥多糖和燕麥多糖,利用健康成人糞便的微生物菌群體外發(fā)酵兩種多糖,評(píng)估發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)酸情況以及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用。本研究以期為開(kāi)發(fā)、剖析食品成分的健康作用提供必要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮山藥 市售河南種植鐵棍山藥;燕麥粒 市售;α-淀粉酶、堿性蛋白酶 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;正己烷(色譜純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇、無(wú)水乙酸鈉 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;丙酸鈉 天津市巴斯夫化工有限公司;丁酸鈉 上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;McCoy′5A培養(yǎng)基 Sigma公司;胎牛血清 Wisent公司;胰蛋白酶 Amresco公司;CCK-8 日本同仁化學(xué)研究所;其他所有試劑均為分析純。

7890N氣相色譜儀 美國(guó)Agilent儀器有限公司;UV-2401PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司;HF-90型CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)力康公司;Model 680型酶標(biāo)儀 美國(guó)BIO-RAD公司;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;C10-2.4A型低速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)廠;DELTA 320型精密pH計(jì)、AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器中國(guó)有限公司;LGJ-1冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)分儀器制造有限公司;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山藥多糖及燕麥多糖的提取

1.2.1.1 原料預(yù)處理 新鮮山藥洗凈去皮,切成大小均一的方塊,勻漿處理,備用。燕麥粒經(jīng)過(guò)粉碎、過(guò)篩(100目),備用。

1.2.1.2 多糖的提取 按照料液比1∶10(w/w)將原料與蒸餾水混合,在適宜溫度下浸提3 h(山藥:100 ℃,燕麥:60 ℃),冷卻到室溫,8000 r/min離心5 min,收集上清液;殘?jiān)貜?fù)浸提2次;合并上清液。上清液用α-淀粉酶在pH7.0、45 ℃下處理4 h,沸水浴滅酶5 min;加入堿性蛋白酶,在pH9.0、55 ℃下再處理4 h,沸水浴滅酶5 min;然后,8000 r/min離心5 min。上清液濃縮4倍后,加入無(wú)水乙醇(終濃度為80%)于4 ℃過(guò)夜,離心,沉淀用乙醇洗滌后凍干,得到多糖粉末。

1.2.1.3 多糖含量測(cè)定 利用苯酚硫酸法[24]測(cè)定多糖的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80 mL于25 mL具塞刻度試管中,加蒸餾水至2.00 mL,分別加5%苯酚溶液1.00 mL,搖勻,迅速加入濃硫酸溶液5 mL,振搖5 min,放置10 min后在沸水浴中加熱60 min,冷卻后采用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490 nm下測(cè)定吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)作圖。

樣品多糖含量的測(cè)定:取0.1 mg/mL多糖樣品溶液1.00 mL放入具塞試管中,按照上述方法測(cè)定吸光值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出葡萄糖濃度,乘以0.9即為多糖含量。

1.2.2 多糖的體外發(fā)酵

1.2.2.1 糞便提取物的制備 采集5個(gè)健康成人(2男3女,年齡為22～24歲)的新鮮糞便,所選對(duì)象在近一個(gè)月未服用抗生素、未得腹瀉和腸炎。采集和處理在1 h內(nèi)完成。取40 g糞便樣品,于200 mL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH6.5)中勻漿2 min,懸浮液用四層紗布粗濾除去顆粒物質(zhì),得到糞便提取物。提取物于-20 ℃保存以備用。

1.2.2.2 體外發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 參考文獻(xiàn)方法[25]稍作修改,配制體外發(fā)酵培養(yǎng)基。組成成分為:2.0 g NaHCO3,2.0 g蛋白胨,2.0 g酵母浸粉,0.5 g牛膽鹽,0.5 gL-半胱氨酸鹽酸鹽,0.01 g CaCl2,0.1 g NaCl,0.04 g K2HPO4,0.04 g KH2PO4,0.01 g MgSO4·7H2O,2.0 mL吐溫-80,蒸餾水定容至1 L。

1.2.2.3 糞便的體外發(fā)酵 在具塞試管中分別加入2.5 mL體外發(fā)酵培養(yǎng)基、2.5 mL糞便提取物和0.5 mL無(wú)菌去離子水,混勻后在37 ℃厭氧條件下分別發(fā)酵24 h和48 h。發(fā)酵結(jié)束后震蕩混合,將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中,8000 r/min離心10 min得到上清液。將上清液的pH調(diào)節(jié)到7.0,并分成兩部分以便用于有機(jī)酸分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn);其中,用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵上清液(即發(fā)酵產(chǎn)物),使用前需要經(jīng)過(guò)0.22 μm的無(wú)菌微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌。發(fā)酵產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.4 兩種多糖的體外發(fā)酵 在具塞試管中分別加入2.5 mL含9 g/L山藥多糖(或燕麥多糖)的體外發(fā)酵培養(yǎng)基、2.5 mL糞便提取物和0.5 mL無(wú)菌去離子水,混勻后在37 ℃厭氧條件下分別發(fā)酵24 h和48 h。其他處理同1.2.2.3。發(fā)酵產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆?。用于?xì)胞實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵產(chǎn)物也經(jīng)過(guò)0.22 μm的無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾。

1.2.3 有機(jī)酸分析

1.2.3.1 短鏈脂肪酸的氣相色譜(GC)分析 根據(jù)參考文獻(xiàn)[26]的方法稍作改進(jìn)。取1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液或發(fā)酵上清液,加入2.40 mL無(wú)水乙醇,混勻后吸取850 μL于安瓿瓶中,加入100 μL濃硫酸和1 mL正己烷,封口后于60 ℃水浴中加熱1 h;不斷震蕩使發(fā)酵產(chǎn)物中的短鏈脂肪酸充分酯化。反應(yīng)完成后冷卻至室溫,劇烈震蕩5 min,靜置分層。上層有機(jī)相用于氣相色譜(GC)分析乙酸、丙酸和丁酸的含量。

表1 乙酸、丙酸、丁酸和乳酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線、最低檢測(cè)限和平均添加回收率Table 1 Standard curves,detection limits,and average recoveries of f acetate,propionate,butyrate,and lactate

注：X,酸的濃度(mmol/L);Y,峰面積或吸光值。氣相色譜條件:色譜柱型號(hào)(HP-5毛細(xì)管柱,30 m×0.32 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度,200 ℃;FID檢測(cè)器溫度,220 ℃;載氣:氮?dú)?流速1 mL/min,分流比為40∶1;燃?xì)?氫氣,流速30 mL/min;助燃?xì)?空氣,流速300 mL/min;隔墊掃吹為3 mL/min;進(jìn)樣體積1 μL。柱箱升溫程序:初始溫度30 ℃,保持3.5 min,以5 ℃/min升溫至40 ℃;再以15 ℃/min升溫至150 ℃。

1.2.3.2 乳酸分析 根據(jù)參考文獻(xiàn)[27]的方法稍作改進(jìn)。取1.00 mL發(fā)酵上清液,分別加入0.5 mL 10.6%亞鐵氰化鉀溶液、0.5 mL 21.9%乙酸鋅溶液,補(bǔ)充蒸餾水至5 mL,迅速混勻,靜置30 min后8000 r/min離心20 min。所得到的上清液適當(dāng)稀釋。5 mL稀釋液加入到預(yù)先加有50 mg Ca(OH)2粉末的試管中,混勻,加入0.8 mL 20% CuSO4溶液混勻,沸水浴加熱3 min,冷卻,8000 r/min離心20 min。吸取0.5 mL上清液于大試管中,置于冰水中,緩慢加入6 mL預(yù)冷的濃H2SO4,邊加邊振蕩,混勻后沸水浴加熱5 min,冰水浴中冷卻,再加入0.125 mL對(duì)羥基聯(lián)苯溶液,充分搖勻,放置30 min,期間每10 min搖一次;沸水浴加熱1.5 min,冰水浴中冷卻后。在波長(zhǎng)565 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)HCT-116細(xì)胞的增殖抑制作用評(píng)估

1.2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) HCT-116細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的McCoy′5A培養(yǎng)基中,于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃,5% CO2)。胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,以1∶3～1∶5的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.4.2 CCK-8法測(cè)定增殖抑制作用 將HCT-116細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,接種密度為8(103個(gè)細(xì)胞/孔,預(yù)培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞貼壁。吸除培養(yǎng)基,加入含發(fā)酵產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)基,發(fā)酵產(chǎn)物的比例為10%(v/v),細(xì)胞處理時(shí)間為24 h和48 h。用100 μmol/L的5-氟尿嘧啶(5-FU)處理細(xì)胞組,作為陽(yáng)性對(duì)照組。用含磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH6.5)的細(xì)胞培養(yǎng)基(10%,v/v)處理細(xì)胞,作為陰性對(duì)照組。調(diào)零組不含有細(xì)胞只含有磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH6.5)的細(xì)胞培養(yǎng)基(10%,v/v)。處理后的細(xì)胞,再加入10 μL CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)2 h,并用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光值(OD),檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次。按下式進(jìn)行計(jì)算抑制率(%),并以此表示細(xì)胞增殖抑制作用。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS軟件(16.0)中的單因素方差分析(One-way AVONA)和Duncan多重比較法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,當(dāng)p<0.05時(shí)即認(rèn)為數(shù)據(jù)間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥多糖及燕麥多糖的糖含量

所得到的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y(吸光度)=0.0121X(葡萄糖濃度)+ 0.0106(R2=0.9991)。根據(jù)分析結(jié)果,所制備的山藥多糖中的糖含量為82.63%,而燕麥多糖中的糖含量則為80.32%。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物中有機(jī)酸的分析

采用1.2.3.1中所述的氣相色譜條件,分析各個(gè)發(fā)酵產(chǎn)物中乙酸、丙酸和丁酸的含量。從所得到氣相色譜圖(圖1A～圖1C)中可以看出,這3種短鏈脂肪酸均能被色譜柱有效分離,保留時(shí)間約為4～9 min。

圖1 GC法分析標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和山藥多糖(B)和燕麥多糖(C)Fig.1 GC profiles of acetate,propionate,and butyrate in standard solution(A)and fermented products of yam polysaccharides(B)and oat polysaccharides(c)注：1：乙酸；2：丙酸；3：丁酸。

采用不同濃度的乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(10～60 mmol/L)或乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1～0.5 mmol/L),得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1。以3倍的信噪比(S/N)計(jì)算,得到這4種酸的檢出限,結(jié)果也列于表1中。分別添加不同濃度的乙酸、丙酸、丁酸和乳酸至發(fā)酵產(chǎn)物中,所得到的添加回收率結(jié)果見(jiàn)表1。表1中的數(shù)據(jù)表明,所采用的GC分析法以及分光光度法可以準(zhǔn)確地測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中的4種有機(jī)酸含量。

2.3 不同時(shí)間兩種多糖的發(fā)酵產(chǎn)酸情況

兩種多糖被糞便提取物中的腸道微生物發(fā)酵后,發(fā)酵體系的產(chǎn)酸情況如表2所示。表中數(shù)據(jù)首先證明,糞便提取物自身也可以發(fā)酵,并產(chǎn)生少量的4種有機(jī)酸。糞便提取物發(fā)酵24 h和48 h后,乙酸、丙酸和丁酸分別增加到9.98～10.48、1.98～2.16、2.69～2.93 mmol/L;不同的是,乳酸先增加到0.16 mmol/L,再降低到0.08 mmol/L。表1中的數(shù)據(jù)也表明,山藥多糖和燕麥多糖均可以被糞便提取物中的微生物發(fā)酵,并產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸和乳酸。數(shù)據(jù)比較結(jié)果表明,添加山藥多糖或燕麥多糖于發(fā)酵體系中,所得發(fā)酵產(chǎn)物中4種有機(jī)酸的含量大幅度提高,明顯高于未發(fā)酵時(shí)各個(gè)體系中的有機(jī)酸含量(p<0.05),也高于糞便提取物自身發(fā)酵產(chǎn)酸。其中,發(fā)酵24 h,山藥多糖和燕麥多糖分別發(fā)酵產(chǎn)生23.28、25.14 mmol/L乙酸，2.49、1.97 mmol/L丙酸，11.04、7.99 mmol/L丁酸和0.19、0.46 mmol/L乳酸;發(fā)酵48 h,兩種多糖分別發(fā)酵產(chǎn)生28.14、42.53 mmol/L乙酸，6.48、2.45 mmol/L丙酸，13.76、9.64 mmol/L丁酸和0.08、0.09 mmol/L乳酸?？梢?jiàn),發(fā)酵時(shí)間從24 h延長(zhǎng)至48 h,發(fā)酵產(chǎn)物中的乙酸、丙酸和丁酸含量得到顯著提高(p<0.05),而乳酸含量明顯降低(p<0.05)。進(jìn)一步比較數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),山藥多糖在發(fā)酵時(shí)的產(chǎn)酸情況與燕麥多糖有所不同;例如山藥多糖發(fā)酵比燕麥多糖發(fā)酵能夠產(chǎn)生更多的丙酸和丁酸、較少的乙酸和乳酸。

表2 山藥多糖及燕麥多糖發(fā)酵體系中有機(jī)酸含量(mmol/L)Table 2 Four acids produced during in vitro fermentation of yam polysaccharides and oat polysaccharides(mmol/L)

注：數(shù)據(jù)后不同上標(biāo)的小寫(xiě)字母表示同一行內(nèi)數(shù)據(jù)差異性顯著(p<0.05)。

已有研究結(jié)果表明,抗性淀粉和魔芋多糖可以被糞便提取物中的腸道微生物降解,產(chǎn)生短鏈脂肪酸和乳酸,并且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),乙酸、丙酸和丁酸的含量增加,而乳酸呈下降趨勢(shì)[28-29],這些結(jié)果與本研究?jī)煞N多糖的發(fā)酵產(chǎn)酸情況相同。乳酸作為發(fā)酵初期產(chǎn)物可被某些微生物利用,合成乙酸[30]和丁酸[31],所以較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵會(huì)減少乳酸含量。本研究的乳酸含量分析結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。Ying[32]等利用豬腸道微生物發(fā)酵水溶性大豆多糖,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵體系中3種短鏈脂肪酸的生成量明顯高于未加入多糖發(fā)酵體系中3種酸的生成量,并且在48 h產(chǎn)酸達(dá)到最大值。Drzikova等[33]研究也表明,燕麥粉體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中丁酸的生成量與發(fā)酵時(shí)間成正比。以上的這些研究工作結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致,證明山藥多糖及燕麥多糖體外發(fā)酵可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸(尤其是丁酸),這可能有助于提高兩種多糖在體內(nèi)的抗結(jié)腸癌活性,因?yàn)槎∷嵋驯蛔C明具有抗結(jié)腸癌作用[21-23]。

2.4 不同時(shí)間發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)HCT-116細(xì)胞的增殖抑制作用

通過(guò)CCK-8法評(píng)估所得到的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)HCT-116細(xì)胞的增殖抑制作用,結(jié)果如表3所示。未發(fā)酵時(shí)(即發(fā)酵時(shí)間為0 h),糞便提取物對(duì)細(xì)胞的抑制作用僅為6.3%、7.9%,而兩種多糖對(duì)細(xì)胞的抑制作用為12.2%～24.5%。糞便提取物自身發(fā)酵24 h和48 h后,發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用為8.4%～25.7%。山藥多糖和燕麥多糖發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用明顯大于糞便提取物自身發(fā)酵產(chǎn)物(p<0.05),達(dá)到44.6%～56.4%(發(fā)酵24 h)或63.5%～69.1%(發(fā)酵48 h)。因此,山藥多糖和燕麥多糖被糞便提取物中的微生物發(fā)酵后,產(chǎn)生了更強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制作用;同時(shí),山藥多糖和燕麥多糖的發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng),發(fā)酵產(chǎn)物所具有的細(xì)胞增殖抑制作用越大。由表3數(shù)據(jù)還可以看出,任何一個(gè)發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞處理24 h或48 h,48 h處理所產(chǎn)生的增殖抑制作用更大。這意味著存在時(shí)間依賴關(guān)系,即發(fā)酵產(chǎn)物處理細(xì)胞的時(shí)間越長(zhǎng),發(fā)酵產(chǎn)物的增殖抑制作用越大。進(jìn)一步比較兩種多糖發(fā)酵產(chǎn)物的細(xì)胞增殖抑制作用差異性,發(fā)現(xiàn)山藥多糖發(fā)酵產(chǎn)物的增殖抑制作用略高于燕麥多糖發(fā)酵產(chǎn)物,但發(fā)酵產(chǎn)物之間的抑制作用差異性并非很大。

表3 各個(gè)發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)HCT-116細(xì)胞處理24 h和48 h的增殖抑制作用(%)Table 3 Growth inhibition of the fermentation products on HCT-116 cells with cell treatment times of 24,48 h(%)

注：數(shù)據(jù)后不同上標(biāo)的小寫(xiě)字母表示同一列內(nèi)數(shù)據(jù)差異性顯著(p<0.05)。

腸道微生物發(fā)酵山藥多糖、燕麥多糖后,對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用明顯地高于未發(fā)酵的多糖,并且48 h發(fā)酵產(chǎn)物具有更高的增殖抑制作用。這一現(xiàn)象極有可能與發(fā)酵產(chǎn)物中丁酸含量增加和乳酸含量降低有關(guān)。丁酸已被證明具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)凋亡和分化的作用[34]。Kautenburger等[35]的研究結(jié)果表明,高濃度的丁酸可以減少腫瘤細(xì)胞的存活率或緩解腫瘤的發(fā)展。Borowicki等[36]的研究結(jié)果也指出,小麥糊粉體外發(fā)酵產(chǎn)生較高的丁酸,導(dǎo)致其對(duì)LT97和HT29細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的增殖抑制作用。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),兩種多糖48 h發(fā)酵可以生成更多的丁酸,因此48 h發(fā)酵產(chǎn)物的增殖抑制作用更強(qiáng)。另外,腫瘤細(xì)胞可以把乳酸作為能量來(lái)源維持自身代謝[37]。乳酸也可以促進(jìn)腫瘤血管生成[38],這意味著,高濃度的乳酸可能會(huì)降低發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用。反過(guò)來(lái),低濃度的乳酸則可能會(huì)有利于發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用。因此,就本研究結(jié)果而言,兩種多糖48 h的發(fā)酵可以產(chǎn)生更多的丁酸、但是降低乳酸的含量,因此提高了發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用。

3 結(jié)論

利用健康成人糞便提取物中的腸道微生物體外發(fā)酵山藥多糖和燕麥多糖,可以產(chǎn)生4種有機(jī)酸(乙酸、丙酸、丁酸和乳酸),并且48 h的發(fā)酵時(shí)間可以提高乙酸、丙酸和丁酸的生成,減少乳酸的生成。山藥多糖和燕麥多糖的發(fā)酵,使得發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116具有更強(qiáng)的增殖抑制作用。初步分析結(jié)果表明,發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng),增殖抑制作用越大;細(xì)胞處理時(shí)間越長(zhǎng),增殖抑制作用越大;發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用極有可能與丁酸含量升高、乳酸含量降低有關(guān)。整體結(jié)果證明,腸道微生物發(fā)酵山藥多糖和燕麥多糖可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸(尤其是丁酸),增強(qiáng)其對(duì)HCT-116細(xì)胞的增殖抑制作用。

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Acid production of the polysaccharides from yam and oatinvitrofermentation as well as the growth inhibition of the fermentation products on human colon cancer cells

YIN Dan-ting,HAO Li-xin,WANG Qi,ZHAO Xin-huai*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Yam polysaccharides and oat polysaccharides were both prepared using water extraction and alcohol precipitation methods. The intestinal microflora in a fecal extract from the health adults were used to ferment the two polysaccharidesinvitro. The amount of four organic acids(acetic,propionic,butyric and lactic acids)in the generated fermentation products were measured,and growth inhibition of these fermentation products on human colon cancer cells(HCT-116 cells)were assessed. Yam polysaccharides and oat polysaccharides contained saccharide contents of 82.63% and 80.32%,respectively. Being fermented for 24 h,yam polysaccharides and oat polysaccharides generated acetic,propionic,butyric and lactic acids in levels of 23.28 and 25.14,2.49 and 1.97,11.04 and 7.99,0.19 and 0.46 mmol/L,respectively. Being fermented for 48 h,yam polysaccharides and oat polysaccharides resulted in the levels of the four acids at 28.14 and 42.53,6.48 and 2.45,13.76 and 9.64,0.08 and 0.09 mmol/L,respectively. With the increase of fermentation time(24～28 h),acetate,propionate and butyrate contents in fermentation products were enhanced clearly(p<0.05),but lactate contents was also decreased markedly(p<0.05). Yam polysaccharides and oat polysaccharides showed lower growth inhibition(less than 24.5%)on the HCT-116 cells. However,the obtained fermentation products exerted growth inhibition effect(46.2%～69.1% and 44.6%～67.3%,respectively)on the cells. And more,a fermentation time of 48 h conferred the fermentation products with higher growth inhibition while treatment of the cells for 48 h also led to higher growth inhibition. It is thus concluded thatinvitrofermentation of the two polysaccharides by the intestinal microflora could bring enhanced anti-proliferation activities to the colon cancer cells.

yam polysaccharides;oat polysaccharides;fermentation;short-chain fatty acids;colon cancer cells

2017-02-21

殷丹婷(1993-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:yindanting@163.com。

*通訊作者:趙新淮(1963-)，男，博士，教授，主要從事食品化學(xué)研究，E-mail:zhaoxh@neau.edu.cn。

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20092325110012)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)15-0296-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.055