李恩偉

(山西省食品工業(yè)研究所，山西太原 030024)

苦蕎蛋白對(duì)腸道有害菌生長(zhǎng)抑制機(jī)理研究

李恩偉

(山西省食品工業(yè)研究所，山西太原 030024)

本文以水溶性苦蕎蛋白為研究對(duì)象,利用體外模擬發(fā)酵,通過(guò)對(duì)苦蕎蛋白作用下小鼠糞便發(fā)酵液中pH、短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的含量以及有害菌(腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌)的數(shù)量進(jìn)行測(cè)定,對(duì)苦蕎蛋白抑制腸道有害菌群生長(zhǎng)機(jī)理進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明:添加不同濃度的苦蕎蛋白與對(duì)照組相比,均可以有效降低有害菌的數(shù)量,其中高劑量組分別使腸球菌、腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌減少了65%、72%和78%(32 h);同時(shí),不同劑量組的苦蕎蛋白使小鼠糞便發(fā)酵液pH分別下降了35%、39%、40%(32 h)。此外,高劑量組的苦蕎蛋白較對(duì)照組分別使乙酸、丙酸、丁酸及乳酸的濃度增加了8.94、33.77、27.34、25.55倍(32 h)。綜上所述,苦蕎蛋白能夠提高腸道中短鏈脂肪酸含量,從而降低腸道環(huán)境的pH,抑制腸道有害菌(腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌)的生長(zhǎng)。

苦蕎蛋白,體外模擬,抑制,pH,短鏈脂肪酸(SCFAs)

腸道菌群被認(rèn)為是機(jī)體的一個(gè)重要“器官”,其組成和數(shù)量在維持人體健康中起重要作用,且主要由益生菌和有害菌(條件致病菌和病原菌)組成[7]。而有害菌是腸道中的非優(yōu)勢(shì)菌群,其在腸道中只占較少的比例,其中腸球菌、腸桿菌以及產(chǎn)氣莢膜梭菌等是腸道中主要的有害菌,它們能夠?qū)⑹澄镏械囊恍┏煞肿優(yōu)槎喾N腐敗物質(zhì)(如:胺、吲哚、酚類)、有毒及致癌物質(zhì)(如:微生物毒素、硝基化合物)等,從而引起某些腸道疾病的發(fā)生[8-10]。研究發(fā)現(xiàn),花生蛋白對(duì)腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用[11]。目前,對(duì)于苦蕎蛋白的研究主要集中在降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂以及其對(duì)益生菌增殖作用等方面,而對(duì)于其在腸道有害菌方面的研究則鮮有報(bào)道。

因此,本文以苦蕎蛋白為研究對(duì)象,通過(guò)模擬結(jié)腸發(fā)酵進(jìn)行體外培養(yǎng),從苦蕎蛋白對(duì)腸道有害菌(腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌)的生長(zhǎng)的抑制影響、小鼠糞便發(fā)酵液pH以及短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的含量三個(gè)方面研究其對(duì)腸道有害菌生長(zhǎng)及抑制作用的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豐1號(hào)苦蕎 購(gòu)于山西省左云縣;SPF級(jí)C57BL/6小鼠45只 購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;L-半胱氨酸鹽酸鹽、膽鹽、維生素K1、氯高鐵血紅素、刃天青、胃蛋白酶(≥3000 U/g)、胰酶(≥4000 U/g)、豬膽汁粉,均為BR級(jí) 購(gòu)于上海寶曼生物科技有限公司;伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、胰月示-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)、膽汁七葉苷疊氮鈉、D-環(huán)絲氨酸、50%卵黃乳液 購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司;乙酸、丙酸、丁酸、乳酸,均為色譜純 購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司;酪蛋白、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏,均為AR級(jí) 購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑(上海)有限公司;其他試劑均為分析純。

體外模擬基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備(1 L):參考Mao Sheng-yong等人[12]的方法,并略作修改。

PBS:磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline),分別配制0.01 mol/L和0.1 mol/L、pH7.0的PBS。其中將配制好的PBS(0.1 mol/L,pH7.0)經(jīng)高壓滅菌后,置于厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃過(guò)夜,用于稀釋腸道內(nèi)容物。

GCMS-TQ8040氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司;YQX-II厭氧培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;3-18K高速冷凍離心機(jī) Sigma儀器有限公司;冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SW-CJ-IFD垂直潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

二維超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定氯化琥珀膽堿原料藥中的雜質(zhì) ………………………… 陳 紅等（7）：941

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠分組 SPF級(jí)C57BL/6小鼠購(gòu)買后于SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)單籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度(25±1.0) ℃,濕度 50%±1.0% RH,并喂食2周以適應(yīng)環(huán)境。在此期間,自由進(jìn)食和飲水(飲用水121 ℃、20 min滅菌,基礎(chǔ)飼料和墊料紫外照射30 min殺菌)。然后,將小鼠隨機(jī)分為五組,空白對(duì)照組喂食基礎(chǔ)飼料，酪蛋白組喂食酪蛋白添加量1 mg/mL的飼料,其余三組小鼠按苦蕎蛋白添加量1、3、5 mg/mL將小鼠分為低、中、高劑量組。

1.2.2 苦蕎蛋白的制備 參考郭曉娜等人[13]的方法并略作修改?？嗍w籽粒粉碎后過(guò)篩,脫脂24 h;取100 g脫脂苦蕎粉以料液比1∶10用0.01 mol/L,pH7.0的PBS溶解,在磁力攪拌器上攪拌2 h;在4 ℃條件下,4000 r/min離心30 min,并向上清液中加入(NH4)2SO4使其濃度為40%,攪拌60 min;在4 ℃條件下,10000 r/min離心15 min,并向上清液中加入(NH4)2SO4使其濃度為80%,攪拌60 min;在4 ℃條件下,10000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀用少量去離子水復(fù)溶;然后將其加入到透析袋中進(jìn)行透析48 h(每4 h換水一次),透析后進(jìn)行凍干(-70 ℃,24 h),凍干粉保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 苦蕎蛋白含量的測(cè)定 參照國(guó)標(biāo)GB 50095-2010中凱氏定氮法進(jìn)行樣品測(cè)定。

1.2.4 腸胃道環(huán)境模擬 體外消化:參考Mills等人[14]的方法并略作修改。具體如下:分別稱取5.0 g苦蕎蛋白，將pH調(diào)節(jié)到2.0±0.05(此時(shí)胃蛋白酶的活性最高),加入2.5 mL溶解在0.1 mol/L鹽酸中的胃蛋白酶溶液(0.108 g/mL),經(jīng)37 ℃恒溫水浴震蕩2 h;經(jīng)過(guò)模擬胃部條件消化后,再用6 mol/L NaOH將溶液的pH調(diào)節(jié)到6.8±0.05(此時(shí)胰酶活性最高),加入12.5 mL溶解在0.5 mol/L Na2CO3中的胰酶膽汁溶液(胰酶和膽汁濃度分別為4.5 mg/mL和28 mg/mL),37 ℃恒溫水浴震蕩2 h;進(jìn)一步模擬食物在腸道中的消化。充分混勻后,將混合液置于透析袋進(jìn)行透析,并于37 ℃,在10 mmol/L NaCl溶液中進(jìn)行透析過(guò)夜,結(jié)束后,再次更換NaCl溶液并繼續(xù)透析2 h,最后將截留消化液進(jìn)行冷凍干燥,于4 ℃冰箱保存用于體外模擬腸道發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。上述步驟以酪蛋白(Casein)作為對(duì)照以及用無(wú)菌水代替苦蕎蛋白作為空白對(duì)照。

1.2.5 體外發(fā)酵液的制備 體外發(fā)酵:參考Estibaliz等人[15]的方法,并略作修改。向無(wú)菌發(fā)酵瓶中加入90 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基并于厭氧工作站中37 ℃進(jìn)行預(yù)還原(12 h)。1 L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有:2 g葡萄糖,2 g蛋白胨,2 g酵母膏,0.1 g NaCl,0.04 g K2HPO4,0.04 g KH2PO4,0.01 g MgSO4·7H2O,0.01 g CaCl2·6H2O,2 g NaHCO3,0.5 gL-半胱氨酸鹽酸鹽,0.5 g膽鹽,10 mL維生素K1,2 mL吐溫-80和1 mL氯高鐵血紅素溶液,將以上成分溶解后調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH至7.0(±0.05),最后加入4 mL 0.025%(w/v)刃天青溶液并滅菌。

收集小鼠新鮮糞便(盡量保持無(wú)菌狀態(tài)),收集后立即用預(yù)還原的磷酸鹽緩沖溶液(PBS,0.1 mol/L,pH7.0)稀釋10倍,并在渦旋振蕩器上充分振蕩3 min,使之徹底勻漿化,500 r/min 離心2 min,分別迅速取上清液10 mL到90 mL預(yù)還原基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,再加入低(0.2 g)、中(0.4 g)、高劑量組(0.8 g)經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理后的苦蕎蛋白水解樣品BWPH(酪蛋白消化凍干樣品PC作為對(duì)照組,無(wú)菌水代替苦蕎蛋白的消化凍干產(chǎn)物CK作為空白對(duì)照)充分混勻;在厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃發(fā)酵32 h,并在發(fā)酵的第0、8、16、32 h取樣。

1.2.6 苦蕎蛋白對(duì)三種有害菌生長(zhǎng)的影響 在發(fā)酵的第0、8、16、32 h,分別取小鼠糞便發(fā)酵液并對(duì)其中的腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù),發(fā)酵液用含有5 g/L 蛋白胨的稀釋液進(jìn)行10倍梯度法稀釋(10-1～10-7),選擇合適稀釋度的樣品(100 μL)并分別涂布于各選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法及條件,見表1),以上操作均在厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行,從取樣至涂板完成所用時(shí)間控制在3 h內(nèi)。每毫升小鼠糞便發(fā)酵液的菌落數(shù)用菌落形成單位的以10為底的對(duì)數(shù)值(lg CFU/mL)表示。

表1 腸道主要菌群培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法Table 1 Cultivation and counting methods of the main intestinal flora

1.2.7 苦蕎蛋白對(duì)發(fā)酵液pH的影響 在發(fā)酵的第0、8、16、32 h,分別取不同樣品小鼠糞便發(fā)酵液,用pH計(jì)測(cè)定其pH。

1.2.8 苦蕎蛋白對(duì)短鏈脂肪酸的影響 短鏈脂肪酸(SCFAs)是腸道微生物發(fā)酵不被人體胃腸道吸收的食物成分而生成的代謝產(chǎn)物,主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、延胡索酸和一些相應(yīng)的支鏈脂肪酸。其中乙酸、丙酸、丁酸及乳酸占90%以上,具有重要的生理功能[16]。為進(jìn)一步研究苦蕎蛋白對(duì)腸道有害菌群生長(zhǎng)抑制作用的機(jī)理,實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠糞便發(fā)酵液中短鏈脂肪酸(SCFAs)的濃度變化進(jìn)行分析。

在發(fā)酵的第0、8、16、32 h,分別取不同樣品小鼠糞便發(fā)酵液,采用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS-MS)法測(cè)定其中短鏈脂肪酸(SCFAs,包括乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的含量。

氣質(zhì)分析條件:毛細(xì)管柱(Rtx-5MS,30 m×0.25 mm×0.25 μm);柱溫:35 ℃保持1 min,以10 ℃/min的速度升溫至100 ℃,保持1 min,再以20 ℃/min的速度升溫至250 ℃,保持3 min;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;離子源溫度:220 ℃;接口溫度:260 ℃;分流方式及分流比:分流進(jìn)樣和10∶1;載氣:He,流速:1 mL/min;溶劑延遲1.5 min。GC分析時(shí)進(jìn)樣量:1 μL[17]。

發(fā)酵液樣品的處理參考Fenster等人[18]的方法,并略作修改。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行ANOVA(LSD檢驗(yàn)),檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05進(jìn)行顯著性分析;每組數(shù)據(jù)均作3個(gè)平行樣,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并運(yùn)用origin 9.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎蛋白對(duì)三種有害菌生長(zhǎng)的抑制作用

由圖1可知,不同實(shí)驗(yàn)組中腸球菌、腸桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量均呈先上升后下降的趨勢(shì),其中,中(MD)、高(HD)劑量組的苦蕎蛋白在發(fā)酵8 h時(shí)達(dá)到最大值,而空白組(CK)、酪蛋白組(PC)及低(LD)劑量組的苦蕎蛋白在16 h時(shí)達(dá)到最大值。另外,在發(fā)酵至32 h時(shí),不同劑量組的苦蕎蛋白中腸球菌、腸桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量均顯著低于CK和PC組(p<0.05),且上述三種有害菌群的數(shù)量隨苦蕎蛋白濃度的增加而顯著性降低(p<0.05),同時(shí),酪蛋白組中腸球菌、腸桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量與空白對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(p>0.05)。培養(yǎng)至32 h時(shí),低、中、高劑量的苦蕎蛋白組較空白對(duì)照組,腸球菌減少了50%、57%、65%,腸桿菌減少了13%、52%、72%,產(chǎn)氣莢膜梭菌減少了66%、73%、78%;而酪蛋白卻使其分別減少了5%、7%、4%。研究結(jié)果表明,苦蕎蛋白能夠顯著地抑制腸道有害菌(腸球菌、腸桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌)的生長(zhǎng),與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的結(jié)論一致。

圖1 苦蕎蛋白體外發(fā)酵對(duì)三種腸道有害菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of in vitro fermentation of different tartary buckwheat protein on numbers of three kinds intestinal harmful bacteria注:CK:空白對(duì)照組;PC:酪蛋白組;LD:低劑量苦蕎蛋白組;MD:中劑量苦蕎蛋白組;HD:高劑量苦蕎蛋白組;A:腸球菌;B:腸桿菌;C:產(chǎn)氣莢膜梭菌,圖2、圖3同。

2.2 苦蕎蛋白對(duì)小鼠糞便發(fā)酵液pH的影響

由圖2可知,各實(shí)驗(yàn)組pH變化趨勢(shì)均呈下降趨勢(shì),而對(duì)照組(CK)卻呈先下降后上升的趨勢(shì),這可能是由于隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,其菌群發(fā)生變化,使產(chǎn)酸菌群減少或氨類物質(zhì)增多而導(dǎo)致;另外,當(dāng)培養(yǎng)至32 h時(shí),其中PC組pH由7.21降到4.72,LD組pH由7.18降到4.68,MD組pH由7.09降到4.35,HD組pH由7.17降到4.33,各組pH下降程度高低為HD>MD>LD>PC>CK。酪蛋白組和不同劑量組的苦蕎蛋白組發(fā)酵液中的pH均低于空白對(duì)照組,且與其之間均具有顯著性差異(p<0.05)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí),不同劑量組的苦蕎蛋白組的發(fā)酵液pH與腸道中三種有害菌(腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌)數(shù)量之間存在正相關(guān)關(guān)系,即發(fā)酵液pH越低,腸球菌、腸桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量越少。由此說(shuō)明,有害菌生長(zhǎng)受到抑制可能是由于腸道菌群發(fā)酵苦蕎蛋白而產(chǎn)生短鏈脂肪酸等酸性物質(zhì),從而使腸道環(huán)境pH降低,這對(duì)于預(yù)防和治療腸道疾病具有重要意義[20]。

圖2 苦蕎蛋白體外發(fā)酵對(duì)pH的影響Fig.2 Effects of in vitro fermentation of different tartary buckwheat protein on pH

圖3 苦蕎蛋白體外發(fā)酵對(duì)短鏈脂肪酸的影響Fig.3 Effects of in vitro fermentation of different tartary buckwheat protein on SCFAs注:A:乙酸;B:丙酸;C:丁酸;D:乳酸。

2.3 苦蕎蛋白對(duì)短鏈脂肪酸的影響分析

由圖3可知,不同劑量的苦蕎蛋白均能促進(jìn)乙酸、丙酸、丁酸、乳酸的生成,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),4種短鏈脂肪酸的濃度均顯著性增加(p<0.05),可能是由于腸道菌群將苦蕎蛋白作為發(fā)酵底物產(chǎn)生短鏈脂肪酸等有機(jī)酸。當(dāng)培養(yǎng)至32 h時(shí),中、高劑量的苦蕎蛋白組(MD、HD)較0 h使乙酸濃度增加了7.29、8.94倍,丙酸濃度增加了25.47、33.77倍,丁酸濃度增加了23.60、27.34倍,乳酸濃度增加了22.61、25.55倍(酪蛋白組(PC)使其濃度分別增加了6.73、27.60、22.93、20.70倍),此結(jié)果與方建東等[21]研究結(jié)論一致。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí),不同劑量組的苦蕎蛋白中乙酸、丙酸、丁酸及乳酸與對(duì)照組之間均具有顯著性差異(p<0.05),且中、高劑量組的苦蕎蛋白對(duì)短鏈脂肪酸(乙酸、丁酸、乳酸)的促進(jìn)作用顯著高于酪蛋白,即苦蕎蛋白對(duì)短鏈脂肪酸的促進(jìn)作用優(yōu)于酪蛋白,且高劑量組較低劑量組效果更加顯著,其原因可能是苦蕎蛋白和酪蛋白均能夠被腸道菌群發(fā)酵,而且苦蕎蛋白更有利于被腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸、乳酸。當(dāng)培養(yǎng)結(jié)束時(shí),圖3中各組中短鏈脂肪酸的濃度可能與圖2中相對(duì)應(yīng)的pH相關(guān),即短鏈脂肪酸濃度越高,其對(duì)應(yīng)的pH越低,從而表明pH的降低可能是通過(guò)發(fā)酵代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸所引起的。

3 結(jié)論

本文初步研究了苦蕎蛋白對(duì)腸道中三種有害菌(腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌)生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)理。結(jié)果表明,苦蕎蛋白對(duì)腸道中腸球菌、腸桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)均具有抑制作用且高于酪蛋白，其中,高劑量的苦蕎蛋白(HD)對(duì)三種菌的抑制作用最強(qiáng),較空白對(duì)照組(CK)分別減少了65%、72%和78%(32 h)。不同劑量的苦蕎蛋白可顯著性地促進(jìn)乙酸、丙酸、丁酸、乳酸濃度的增加,且中、高劑量組的苦蕎蛋白對(duì)其促進(jìn)作用顯著高于酪蛋白(p<0.05),其中,高劑量組的苦蕎蛋白較對(duì)照組分別使乙酸、丙酸、丁酸及乳酸的濃度增加了8.94、33.77、27.34、25.55倍(32 h)。而產(chǎn)生的短鏈脂肪酸進(jìn)一步使腸道pH降低,且不同劑量苦蕎蛋白組的pH均低于酪蛋白(高劑量組苦蕎蛋白的pH為4.33,而酪蛋白組為4.68)。從而證明了苦蕎蛋白對(duì)腸道有害菌的生長(zhǎng)具有抑制作用,且這種抑制作用是通過(guò)促進(jìn)腸道中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生,進(jìn)而降低腸道的pH。

綜上所述,苦蕎蛋白是可能通過(guò)促進(jìn)乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸的生成,從而降低腸道的pH來(lái)抑制腸道有害菌(腸球菌、腸桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的)的生長(zhǎng)。

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Effect of tartary buckwheat protein on the growth of harmful bacteria in intestinal

LI En-wei

(Shanxi Food Industrial Research Institue,Taiyuan 030024，China)

In this paper,water-soluble buckwheat protein was used as the research object,and the pH and the quantity of short-chain fatty acids(acetic acid,propionic acid,butyric acid,lactic acid)and harmful bacteria(Enterococcus,EnterobacteriaceaeandClostridiumperfringens)were determined by simulatedinvitrofermentation. The mechanism of buckwheat protein inhibition of intestinal harmful flora growth was investigated. The results showed that the addition of different concentrations of buckwheat protein could reduce the number of harmful bacteria compared with the control group. The high dose group reduced the quantity ofEnterococcus,EnterobacterandClostridiumperfringensby 65%,72% and 78%(32 h). The tartary buckwheat protein in different dosage groups decreased the pH of the fecal fermentation broth by 35%,39% and 40%(32 h),respectively.In addition,the concentration of acetic acid,propionic acid,butyric acid and lactic acid in high dose group were increased by 8.94,33.77,27.34 and 25.55 times(32 h),respectively,compared with the control group.In summary,tartary buckwheat protein can improve the intestinal short-chain fatty acid content,thereby reducing the intestinal environment pH,inhibit intestinal harmful bacteria(Enterococci,Enterobacteriaceae,Clostridiumperfringens)growth.

tartary buckwheat protein;invitrosimulation;inhibition;pH;short-chain fatty acids(SCFAs)

2017-01-05

李恩偉(1962-),男，本科，研究方向：食品工程，E-mail:sxfood@126.com。

TS201.4

A

1002-0306(2017)15-0306-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.057