汪 雄,趙 燕,徐明生,姚 瑤,張夢雅,涂勇剛,*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室,食品科學與工程學院,江西南昌 330045; 2.南昌大學,生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心,江西南昌 330047)

食源性抗炎肽的制備、分離、鑒定及其抗炎機制研究進展

汪 雄1,趙 燕2,徐明生1,姚 瑤1,張夢雅1,涂勇剛1,*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室,食品科學與工程學院,江西南昌 330045; 2.南昌大學,生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心,江西南昌 330047)

生物活性肽是生命和食品科學領域的研究熱點之一。其抑菌、降血壓、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗炎等活性已相繼被證實,其中肽的抗炎作用研究相對較為薄弱。慢性炎癥嚴重影響人體健康,而傳統(tǒng)治療炎癥藥物均有一定副作用,食源性抗炎肽的開發(fā)應用有望為機體炎性反應提供新的抗炎策略。本文綜述了食源性抗炎活性肽的制備、分離純化、鑒定以及抗炎活性與分子作用機制的研究進展,并對其研究進行了展望,為食源性抗炎肽的進一步深入研究提供參考。

食源性,抗炎肽,炎癥,免疫,抗炎機制

炎癥是機體受致炎因子損傷后所發(fā)生的一種以防御反應為主的重要進行性過程。當機體發(fā)生慢性炎癥,機體免疫耐受遭受破壞,激活相關免疫細胞,使其釋放花生四烯酸、細胞因子、前列腺素、組胺等炎性介質(zhì)。炎性介質(zhì)通過激活細胞內(nèi)外炎癥信號通路,刺激免疫細胞分泌過量的IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎細胞因子,這使得機體內(nèi)促炎細胞因子和抑炎細胞因子不平衡,而促炎細胞因子又會促進細胞炎癥反應。然而,過度的免疫應答最終可能導致組織損傷,對人體產(chǎn)生重大傷害[1-2]。

目前預防和治療炎癥的方法包括抑制細胞免疫反應,減少促炎細胞因子分泌,抑制或干預NF-κB和MAPK信號通路。主要的藥物有糖皮質(zhì)激素類藥物、非特異性免疫抑制劑和抗-TNF-α抗體等[3-4]。毫無疑問,上述藥物對病情具有治療或緩解作用,但同時也會帶來一定的副作用,比如依賴性、過敏性,導致病人免疫力下降以及代謝紊亂等[5]。因此,研究開發(fā)新的、安全的、具有治療或輔助治療炎癥的天然產(chǎn)品或天然產(chǎn)物的衍生產(chǎn)品成為越來越多研究者關注的焦點。

生物活性肽一直是生命和食品科學領域的研究熱點之一。近年來,國內(nèi)外諸多研究證實了食源性蛋白質(zhì)水解物和多肽在細胞和動物水平均具有良好的抗炎作用,這為研究開發(fā)新型安全抗炎藥物提供了很好的方向和途徑。由此,本文對抗炎活性肽的相關研究進展進行綜述,并對其研究和應用進行展望,以期為抗炎肽的進一步深入研究和運用提供參考。

1 食源性抗炎肽概述

食源性抗炎肽是一類對生物機體有益,通過綜合調(diào)控細胞因子的分泌、炎性介質(zhì)合成釋放和炎癥信號通路調(diào)節(jié)機體炎癥反應,由2個或多個氨基酸組成,來源于可食用性蛋白質(zhì)的一類小分子肽。通常,這些肽在完整的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中不表現(xiàn)其生物活性,必須通過酶解或者酸堿等極端條件釋放出來才發(fā)揮特定活性。植物和動物蛋白質(zhì)是抗炎肽的主要來源,目前已證實,來源于蛋、肉、牛奶、魚、小麥,甚至蔬菜等的多肽和酶解復合物具有較好的抗炎效果[6-8]。禽蛋蛋白中含有豐富的蛋白質(zhì),主要是卵白蛋白。源于雞蛋中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的三肽IRW對上皮炎性反應和氧化應激具有保護作用[6]。這種小分子肽通過胞吞或者肽運輸載體很容易進入細胞,并且與細胞膜上的相關免疫受體結(jié)合起到調(diào)節(jié)炎癥作用。卵黃高磷蛋白含豐富的絲氨酸,其水解物能夠顯著性抑制促炎細胞因子分泌和釋放,從而抑制炎癥反應[7]。在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導豬結(jié)腸炎模型中,大豆蛋白水解物通過降低過氧化物酶(MPO)活性和促炎細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌,促進淋巴系統(tǒng)免疫細胞成熟,改善豬的體重變化以及結(jié)腸組織,從而減輕豬結(jié)腸炎癥反應[8]。綜上所述,抗炎肽在體內(nèi)和體外能夠通過調(diào)節(jié)細胞因子起到緩解和抑制炎癥的良好作用。然而,關于這些肽是如何進入細胞體內(nèi),以及其如何介導細胞炎性反應并沒有做深入研究。

目前,應用生物活性多肽作為藥物、疫苗、導向藥物、診斷試劑、酶抑制劑及藥物先導化合物等具有廣泛的理論和應用價值[9]。但是,有關生物活性肽在抗炎方面的研究處在起步階段,而機體內(nèi)的炎癥對身體健康影響極其重大。因此,進一步研究與開發(fā)抗炎肽產(chǎn)品具有重要的意義和應用價值。

2 食源性抗炎肽的制備

食源性抗炎肽的常用制備方法主要有直接分離食物中的天然抗炎肽、酶解食物蛋白質(zhì)獲得抗炎肽、微生物發(fā)酵法制備抗炎肽等。

2.1 食源性天然抗炎肽

天然抗炎活性肽具有高效、低毒、無污染等特點,在畜牧、養(yǎng)殖、食品及藥品中都有廣泛的應用前景。然而生物體內(nèi)含天然活性抗炎肽很微量,并且分離提純過程很復雜,很難得到純度高的抗炎活性肽。

目前已經(jīng)從大豆、柑橘、莧菜等植物性食物中分離得到天然抗炎肽。大豆是蛋白質(zhì)的豐富來源,De Mejia等[10]運用RP-HPLC和MALDI-TOF等技術,結(jié)合超濾從大豆中分離獲得的Lunasin抗炎肽片段,分子量分別為5、8、14 kDa,這些抗炎肽片段在LPS誘導巨噬細胞炎癥模型中表現(xiàn)較好抗炎作用。Moronta等[11]采用高效液相色譜法從莧菜分離得到序列為SSEDIKE的抗炎活性肽,該肽可以抑制人結(jié)腸癌細胞Caco-2趨化因子CCL20表達,具有抑制炎癥的免疫特性。Noh等[12]從柑橘皮中分離出具有抗炎作用的柑橘環(huán)肽XI。雖然,通過色譜和超濾等手段能夠從食源性物質(zhì)中分離得到部分天然抗炎活性肽,但是,這些肽的純度普遍不高。另一方面,通過這些化學手段提取得到的肽活性可能會受到影響。這些都是阻礙天然抗炎肽實際運用的因素。

2.2 酶法制備

因酶法制備抗炎肽具有生產(chǎn)條件溫和,水解易控制,成本低,獲得產(chǎn)品安全性極高等特點,利用不同種類的酶水解蛋白質(zhì)獲得的抗炎活性肽已成為最主要的制備抗炎肽的方法。在制備抗炎肽的過程中,動物胃蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰酶)、植物胃蛋白酶(木瓜蛋白酶)以及微生物蛋白酶(枯草桿菌中性蛋白酶)等均可使用。然而水解酶酶切位點不同,得到的肽的種類繁多,因此選擇合適的酶以及酶解條件很關鍵。另外,鑒于酶具有專一性、酶切位點有限等特點,故單一酶酶解制備抗炎肽或含抗炎肽酶解復合物效果有時不佳,我們通常需要選擇適當?shù)膹秃厦高M行酶解以獲得目的產(chǎn)物。目前,通過酶解法已經(jīng)從雞蛋、大豆、玉米、魚等中分離得到各種抗炎肽。

Cheng等[13]人用堿性蛋白酶和風味酶分別酶解煮熟的金槍魚湯汁,發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解獲得的肽片段抗炎效果更佳,并且運用Q-TOF和ESI手段測得抗炎肽氨基酸序列分別為PRRMMNGGR和MGPAMMRTMPG,分子量分別為1543.8、1211.5 Da。通過酶解手段獲得的抗炎肽抗炎能力存在差異性,這和肽片段的分子量存在一定的關系,小分子量的多肽或者氨基酸更容易被機體吸收。Shi等[14]采用堿性蛋白酶和中性蛋白酶復合酶酶解雞蛋殼膜,結(jié)合超濾技術,已經(jīng)從雞蛋殼膜中獲得不同分子量的小分子抗炎肽復合物,發(fā)現(xiàn)超濾得到的各組分表現(xiàn)出不同程度的抗炎活性,這表明分子量和氨基酸組成影響抗炎肽活性。另外,這些肽復合物在體外化學和體內(nèi)細胞水平表現(xiàn)出一定的清除自由基、還原鐵離子等能力。Iskandar等[15]利用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解乳清蛋白得到的酶解復合物,經(jīng)過超濾獲得不同分子量的肽片段可以調(diào)控NF-κB信號通路、抑制炎癥因子表達。Ahn等[16]采用六種酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風胃蛋白酶、復合蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶)酶解鮭魚胸鰭,結(jié)合凝膠色譜和超濾技術獲得抗炎肽片段SPHF1,并且發(fā)現(xiàn)在LPS誘導RAW.264.7炎癥模型中,SPHF1能夠抑制細胞NO釋放和減少IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子合成。我們可以看到,不同復合酶制備得到的多種小分子肽表現(xiàn)出來的活性能力有高低。因此,選擇合適的酶或者復合酶在制備抗炎活性肽過程中至關重要。

雖然通過酶解技術已經(jīng)分離得到很多抗炎肽以及復合物,但是目前獲得生物活性肽的大量研究主要集中在蛋白質(zhì)水解酶和蛋白質(zhì)來源篩選以及酶解條件優(yōu)化上,研究者由于不知道原料蛋白的一級結(jié)構(gòu),往往是隨機選取蛋白原料和蛋白水解酶,通過對不同酶解液的活性比較來確定蛋白原料和酶類,因此此法制備抗炎肽存在盲目性,得到的抗炎肽成分復雜。為了快速篩選出抗炎活性肽,最近幾年提出了模擬酶切特定已知序列蛋白制備小分子多肽,建立酶解肽庫,并對其抗炎肽進行抗炎活性表征。

2.3 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法也是獲得生物活性肽的有效方法之一,該法主要是運用微生物體內(nèi)的酶系統(tǒng)水解特定蛋白質(zhì)。牛奶中含豐富的酪蛋白,經(jīng)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生很多活性多肽,Hirota等[17]從細菌發(fā)酵酪蛋白產(chǎn)物中分離得到的三肽VPP能夠降低人血管上皮細胞NO的釋放,減輕血管擴張。同樣,豆類發(fā)酵制品也具有許多生物活性肽,來自韓國的發(fā)酵型豆制品Chungkookjang中含有豐富的生物活性肽,這些抗炎肽在人乳腺癌細胞中,可抑制促炎細胞因子表達并且能夠激活轉(zhuǎn)化生長因子而起到減輕炎性反應的作用[18]。Elfahri等[19]采用瑞士乳酸菌在37 ℃條件下發(fā)酵牛奶蛋白12 h,獲得含有4～18個氨基酸殘基短肽混合物,這些短肽可以促進人外周血單核細胞中IL-10和IFN-γ合成分泌而減輕細胞炎性反應。

微生物發(fā)酵的原材料都富含豐富的蛋白質(zhì),并且微生物體內(nèi)含有各種代謝酶,因此控制發(fā)酵過程條件可以產(chǎn)生不同活性肽,另一方面這些小分子活性肽很容易被人體腸道吸收,從而更好地發(fā)揮它們的作用。

2.4 其它方法

隨著生物活性肽研究的不斷進行,除了上述方法,化學合成、基因工程等方法也用于抗炎肽的制備[20]。基因工程法尚不完善,會出現(xiàn)翻譯后產(chǎn)物難以修飾,容易形成不恰當折疊構(gòu)型等不利影響[21]?；瘜W合成法是基于抗炎肽氨基酸序列已知情況下,從C斷開始添加目的氨基酸的一個復雜過程。Kim等[22]通過固相合成法得到一種嵌合肽FKRLKKLISWIKRKRQQNH2,并且發(fā)現(xiàn)該肽可以阻斷RAW264.7中LPS與TLR4受體結(jié)合,從而抑制LPS誘導引起的細胞炎性反應。另外,有學者選用酸堿降解蛋白質(zhì)從而獲得活性氨基酸和多肽,但是,該法具有產(chǎn)物復雜、破壞氨基酸、難以控制水解程度和破壞多肽結(jié)構(gòu)等缺點[9]。

3 食源性抗炎肽分離純化與鑒定

抗炎肽的分離純化的進步和改進與其是否能夠?qū)崿F(xiàn)自動化和連續(xù)生產(chǎn)有關?，F(xiàn)階段,抗炎肽分離純化技術主要有鹽析法、超濾、凝膠色譜、離子交換色譜和高效逆流色譜等。色譜技術分辨率和靈敏性高,其在活性肽分離純化中運用最廣泛。色譜法相對傳統(tǒng)的鹽析或者有機溶劑萃取具有能夠更好地保護抗炎肽活性的特點。由于通過酶解或者酸解水解獲得的抗炎肽復合物成分復雜,通常樣品在進行液相色譜純化前,需要經(jīng)過色譜柱初步純化,比較常用的有葡聚糖凝膠柱。Ma等[23]人利用葡聚糖凝膠柱結(jié)合高效液相,在波長280 nm,流速8 mL/min,0.1%TFA水溶液(A)和0.1%TFA乙腈溶液(B)系列梯度(5% B 2 min;50% B 50 min;60%B 62 min)的條件下洗脫,從乳清蛋白中獲得8個肽,其中只有DYKKY和DQWL能夠減輕LPS誘導的RAW264.7細胞炎性反應。超濾可有效獲得不同分子量肽段,從而有效篩選出活性肽片段。目前,利用色譜分離法結(jié)合超濾手段已經(jīng)從禽蛋[24]、牛乳[25]、大豆[26]中分離出各種具有抗炎活性的小分子肽,分子量主要集中在3～10 kDa?？偟膩碚f,根據(jù)待分離的樣品理化性質(zhì)(電荷、分子大小、極性等)和分離方法原理選擇一種或多種結(jié)合的方式,避免分離的盲目性。

對分離純化所得到的抗炎肽進一步進行活性和結(jié)構(gòu)分析,繼而可以確定其構(gòu)效關系,這對抗炎肽在藥代動力學領域和進一步的應用具有很大的促進作用。傳統(tǒng)測定蛋白質(zhì)和多肽序列的方法主要是Edman降解和DNA轉(zhuǎn)譯法。目前,隨著質(zhì)譜、色譜等技術不斷成熟,氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、解析質(zhì)譜、IR、UV光譜、圓二色譜、生物活性鑒定法、放射性同位素標記法及免疫學方法等都已應用于多肽類物質(zhì)的結(jié)果鑒定、分析檢測之中?？焖僭愚Z擊質(zhì)譜(FAB-MS)避免了傳統(tǒng)樣品加熱氣化的缺陷,而且在測序過程具有用量少、方便快速、適合小分子肽檢測的優(yōu)點[27]。除此之外,以已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)制備獲得的多肽,可通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)以及蛋白質(zhì)組學技術快速確定其結(jié)構(gòu)。MALDI-TOF-MS具有操作簡單、快速、譜圖直觀等特點,能夠準確測定分子量和結(jié)構(gòu)序列。Ma等[23]人利用UPLC-Q-TOF-MS手段鑒定從乳清蛋白中分離出的抗炎組分活性肽序列為DYKKY和DQWL。然而,各種方法都有其適用性和局限性,在實際使用中主要根據(jù)研究目的和效果進行選擇和方法聯(lián)用。

4 食源性抗炎肽在體內(nèi)和體外的抗炎活性評價

4.1 食源性抗炎肽在細胞炎癥模型中的抗炎作用

體外細胞炎癥模型具有快速、經(jīng)濟、周期短等優(yōu)點,因此,由TNF-α或LPS刺激誘導的Caco-2、HT-29和巨噬細胞等的炎癥模型被廣泛用于各種活性物質(zhì)的篩選與驗證研究。近年來,很多學者利用此模型證實了來源于牛奶、雞蛋和大豆等的食源性多肽和蛋白質(zhì)酶解物的抗炎活性,并對其作用機制作了初步探討。

眾所周知,牛奶中富含大量的酪蛋白和乳清蛋白,這些蛋白經(jīng)水解、消化或者發(fā)酵可以釋放大量活性肽。研究表明來自酪蛋白發(fā)酵過程中的三肽VPP和IPP可以抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)活性和NO釋放,從而緩解了與粥樣動脈硬化有關的炎癥[17]。Nielsen等[28]通過酶解酪蛋白得到的混合水解物和多肽能夠抑制被激活的巨噬細胞炎癥因子的釋放。乳清蛋白水解物通過減少呼吸道和腸道上皮細胞IL-8細胞因子釋放,從而抑制炎癥[29]。乳鐵蛋白不僅具有抗菌作用,其水解多肽在人軟骨和滑膜細胞實驗中也表現(xiàn)抗炎作用,表明其在關節(jié)炎治療中具有潛在的作用[30]。

表1 食源性抗炎肽的分離純化方法以及在體內(nèi)、外的抗炎活性Table 1 Separation and purification of food-derived anti-inflammatory peptides and its anti-inflammatory activity in vitro and in vivo

雞蛋也是抗炎活性肽的一個主要來源。Majumder等[31]發(fā)現(xiàn)從雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解物中分離出的三肽IRW和IQW能夠有效地降低促炎細胞因子的釋放、調(diào)節(jié)NF-κB炎癥信號通路中相關基因的表達,并且表現(xiàn)出抗氧化和抑制ACE活性,從而進一步增強其生物活性作用。但是,研究發(fā)現(xiàn)IRW和IQW結(jié)構(gòu)中單獨的氨基酸卻不顯示這些活性,這說明這些生物活性必須基于完整的三肽結(jié)構(gòu),也進一步揭示抗炎肽和其構(gòu)象具有重要關系。

植物性食物(主要是大豆)是抗炎肽和蛋白酶解物的另外一種重要豐富來源。來源于大豆酶解物中的三肽VPY,通過寡肽PepT-1運輸通過Caco-2單層細胞模型并被吸收,能夠有效減少促炎因子釋放[32]。Hernández-Ledesma等[33]研究發(fā)現(xiàn)大豆抗炎肽Lunasin能夠有效地通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號通路,從而降低LPS誘導引起的小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥細胞因子IL-6、TNF-α和前列腺素E2產(chǎn)生量。Haria等[34]從小麥面筋中提取的多聚焦谷氨酰亮氨酸(PyroGlu-Leu)可以抑制LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7促炎因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生。

4.2 食源性抗炎肽在動物炎癥模型中的抗炎作用

基于抗炎肽在細胞模型中通過抑制炎癥因子合成以及調(diào)節(jié)相關炎癥信號通路表現(xiàn)出抗炎作用,一些抗炎肽和蛋白質(zhì)酶解物在結(jié)腸炎、關節(jié)炎、動脈粥樣硬化等動物疾病模型中被進一步研究,以探討抗炎機制及劑量關系。

乳制品本身就含有很多活性肽,由此,乳源性多肽的抗炎活性在體內(nèi)動物實驗中被大量研究。Chatterton等[35]研究發(fā)現(xiàn),乳源性三肽VPP和IPP在小鼠結(jié)腸炎模型中能夠有效緩解小鼠炎癥癥狀,從而減輕炎癥作用。研究表明,乳清蛋白水解物可以減輕小鼠皮炎癥狀[35],而經(jīng)嗜熱乳酸桿菌發(fā)酵酪蛋白獲得的水解物能夠緩解小鼠結(jié)腸炎[36]。另外一方面,很多植物性抗炎肽和富含抗炎肽的水解物的活性作用也被在體內(nèi)實驗中得到驗證。大豆水解三肽VPY在豬腸道炎癥模型中具有抑制細胞因子表達、減少氧化應激和保護機體組織等活性功能,這表明該肽有望用于治療腸道炎癥[8]。在DSS誘導的小鼠結(jié)腸炎模型,VPY可以改善小鼠結(jié)腸長度、減少組織中炎癥因子的表達、緩解小鼠體重減輕[32]。通過對小鼠灌胃玉米水解蛋白,發(fā)現(xiàn)蛋白復合物能夠減輕小鼠炎癥損傷[37]。

雖然,許多實驗證實抗炎肽在體外細胞和體內(nèi)動物炎癥模型中能夠有效抑制炎癥,但是,關于抗炎肽在人體內(nèi)是否有抗炎作用以及如何發(fā)揮其作用仍然有待研究,這將對開發(fā)治療炎癥藥物帶來新的方向。表1總結(jié)了各種食源性抗炎肽的分離純化方法以及在體外和體內(nèi)抗炎作用。

5 食源性抗炎肽的作用機制

炎癥是一個受免疫細胞、代謝酶、炎癥介質(zhì)等因素綜合調(diào)控的復雜的進行性過程。食源性抗炎肽通過調(diào)節(jié)細胞因子基因的表達、抑制炎性介質(zhì)的合成、調(diào)控炎癥信號通路等方式達到減輕炎癥的作用。

5.1 調(diào)節(jié)細胞炎癥因子合成釋放

機體的免疫應答是通過體內(nèi)錯綜復雜的控制單元調(diào)控完成。在這些控制單元中,細胞因子的平衡在調(diào)節(jié)炎癥過程起著重要調(diào)節(jié)作用。當外源性致炎因子刺激機體產(chǎn)生炎癥,免疫細胞合成并且釋放相關促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α和抑炎細胞因子IL-10、TGF-β,其中促炎細胞因子進一步促進細胞炎性反應,使得機體持續(xù)免疫[43]。抗炎肽通過調(diào)節(jié)細胞因子分泌平衡,抑制促炎因子合成并且上調(diào)抑炎因子表達,從而起到減輕致炎因子誘導的炎性反應的作用。

Mukhopadhya等[44]研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白水解物和肽片段能夠減少細胞內(nèi)IL-8分泌,并且在DSS誘導豬結(jié)腸炎癥模型中發(fā)現(xiàn),通過對酪蛋白水解物超濾截取獲得的1 kDa分子量肽片段能夠顯著抑制促炎細胞因子IL-1α、IL-1β表達。來源于雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的三肽IRW和IQW在腸上皮細胞實驗中,通過減少IL-8、IL-6合成和抑制細胞粘附分子(ICAM-1和VCAM-1)表達來減輕炎癥;而且,在小鼠動物炎癥模型中體系,IRW和IQW也能有效降低小鼠結(jié)腸組織中IL-8、IL-6、TNF-α促炎細胞因子分泌,促進IL-10抑炎因子分泌,從而達到減輕小鼠炎癥的作用[6,31]。大豆三肽VPY在2 mmol/L濃度能夠顯著降低Caco-2和THP-1中IL-6、IL-17、IL-1β、IFN-γ分泌,并下調(diào)DSS誘導的小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ基因表達[32]。Millán等[45]研究發(fā)現(xiàn),來源于羽扇豆抗炎活性肽GPETAFLR可以顯著降低THP-1分化的巨噬細胞中TNF-α、IL-1β分泌,并且促進因炎因子IL-10分泌。

5.2 抑制炎癥介質(zhì)合成與釋放

炎癥期間,受損組織和T細胞分泌的代謝酶等化學介質(zhì)參與炎癥反應,代謝酶包括誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶(COX-2),炎癥介質(zhì)有前列腺素(PGE2)和白三烯等。

Noh等從柑橘皮中分離得到的柑橘環(huán)肽XI在LPS誘導RAW264.7細胞炎癥模型中表現(xiàn)較好抗炎活性,其作用機制是抑制iNOS和COX-2代謝酶的表達,從而減少NO和PGE2的合成釋放。另一方面,通過調(diào)節(jié)NF-κB和MAPK信號通路減少IL-6、TNF-α促炎因子分泌,阻止炎癥進一步惡化循環(huán)[12,46]。源于大豆Lunasin抗炎肽片段,與陽性對照組比較,樣品處理組濃度在0.1 μmol/L時對COX-2活性抑制率分別為40.9%±6.6%、45.2%±4.8%和60.5%±2.9%,但是三者對COX-1活性均沒有影響[10]。Kim等[22]研究發(fā)現(xiàn)貽貝可食用部分酶解產(chǎn)物MEHs中分子量大于5 kDa的肽片段,在LPS誘導RAW264.7炎癥模型中可減少NO和PGE2分泌,并且抑制iNOS和COX-2基因表達從而抑制細胞炎性反應。

5.3 調(diào)控炎癥相關信號通路及其轉(zhuǎn)錄因子表達

雖然抗炎肽能夠通過調(diào)節(jié)細胞炎癥因子來減輕炎癥,但此調(diào)節(jié)作用主要是通過胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導途徑來完成的。Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus ki-nase-signal transduction and transcription activator,JAK-STAT)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor-kapa B,NF-κB)是細胞內(nèi)3條重要信號通路,在炎癥信號轉(zhuǎn)導調(diào)控中具有重要意義[47-48],目前研究表明肽的抑制細胞炎性反應作用主要和NF-κB與MAPK通路相關。

炎癥誘導因子LPS的信號轉(zhuǎn)導過程首先是激活細胞膜上特殊受體,主要是CD14和TLR-4,從而活化NF-κB信號通路[49]。Iskandar等[15]研究發(fā)現(xiàn)高壓處理過后的乳清蛋白水解物能夠抑制LPS引起的細胞中促炎細胞因子TNF-α、IL-8分泌,但是對TNF-α和IL-1β誘導刺激細胞分泌IL-8均無影響,這充分說明乳清蛋白水解物可能是通過Toll樣受體通路減少促炎因子表達,上調(diào)抑炎因子表達量。另一方面,實驗結(jié)果表明其水解物并不下調(diào)TLR4受體的表達,提示乳清蛋白可能是通過抑制LPS與Toll樣受體結(jié)合阻止NF-κB信號通路激活,從而調(diào)控細胞因子分泌起到調(diào)控炎癥的作用。另外,可能由于蛋白質(zhì)和氨基酸長鏈空間結(jié)構(gòu)復雜,可以與LPS相互作用或結(jié)合,從而減少LPS對細胞的刺激作用。Huang等[50]從雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中分離得到的三肽IRW在50 μmol/L通過抑制IκBα磷酸化阻斷NF-κB細胞信號通路,從而減少細胞膜上粘附分子表達,調(diào)控TNF-α誘導的細胞炎性反應。De Mejia等研究表明,在TNF-α誘導巨噬細胞炎癥模型中,用超濾截取獲得的5 kDa大豆天然抗炎肽片段預處理巨噬細胞18 h,發(fā)現(xiàn)該肽片段能夠抑制TNF-α引起與NF-κB信號通路相關的p65和p50蛋白表達量。在TNF-α誘導Caco-2炎癥模型中,膳食風味化合物二肽γ-EC和γ-EV通過刺激鈣離子敏感受體CaSR磷酸化,導致CaSR-β-arrestin2與TNF-α相關受體競爭結(jié)合,使TNF-α誘導細胞炎癥信號通路中IκBα和JNK磷酸化減少,從而可阻斷NF-κB通路和MAPK(JNK)通路激活,抑制由TNF-α誘導的細胞炎性反應[51]。研究發(fā)現(xiàn)細菌發(fā)酵酪蛋白獲得的三肽VPP在體外通過衰減白細胞內(nèi)皮相互作用,減少白細胞滲出,并且抑制炎癥信號通路JNK減少粗鹽細胞因子合成與釋放從而起到調(diào)節(jié)炎癥的作用[39]。

食源性抗炎肽可通過上述炎癥信號通路的調(diào)控起到抑制炎癥作用,不同的抗炎肽其調(diào)控的信號通路不一樣。大多數(shù)研究表明,抗炎肽通過多條信號通路共同調(diào)節(jié)炎性反應,并且調(diào)控信號通路中細胞因子、炎癥介質(zhì)的表達?？傊?抗炎肽通過細胞信號通路介導炎癥是一個復雜的過程,其精確的作用和調(diào)控機制仍然是今后研究的重要方向。

6 展望

隨著對生物活性肽越來越多的深入研究,抗炎肽有望作為潛在的抗炎制劑添加到各種功能性食品當中起到膳食干預炎癥的作用,甚至直接用于炎癥治療。但是抗炎肽的篩選、作用機制、構(gòu)效關系以及抗炎肽應用仍然有待進一步研究。主要從以下幾個方面:

建立抗炎肽的快速篩選方法：目前抗炎肽篩選方法有限,對于肽的分離策略一般是以體外活性模型為導向,采用超濾、層析,結(jié)合高效液相色譜等技術手段進行跟蹤式篩選。毫無疑問,此思路不但耗時、成本高,而且存在組分越分離活性越小、體外活性較好但體內(nèi)卻無活性的風險,使得研究無功而返。因此,有必要研究和建立抗炎肽的快速篩選方法,這將為建立新的肽庫做出貢獻。

闡明抗炎肽的作用分子機制：抗炎肽可以通過調(diào)節(jié)細胞因子分泌、炎性介質(zhì)合成釋放與調(diào)控炎癥相關信號通路等多方面表現(xiàn)出抗炎活性,但目前大多數(shù)研究皆為驗證性推論,缺乏深入系統(tǒng)的分子機制研究?？傮w上來講,抗炎肽均是通過調(diào)節(jié)與炎癥相關介質(zhì)和細胞信號通路來減輕炎性反應,但是其是如何達到此調(diào)控作用的尚需進一步闡明,作用機制的不明確將會妨礙抗炎肽在醫(yī)藥、畜牧業(yè)、食品等各行業(yè)中的廣泛應用。氨基酸是組成蛋白質(zhì)的物質(zhì)基礎,未來,我們應該把重點轉(zhuǎn)移到研究氨基酸代謝與免疫調(diào)節(jié)之間的關系。

解析抗炎肽的構(gòu)效關系：抗炎肽的分子量大小、帶電性質(zhì)、甚至酸堿性都可能影響其抗炎活性。現(xiàn)階段抗炎肽的研究較為薄弱,對其構(gòu)效關系僅為簡單的理論推測,缺乏充足、系統(tǒng)的實驗依據(jù),不能令人信服。隨著對抗炎肽的不斷深入研究,我們應該將多肽的活性與其空間結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來,如α-螺旋、β-折疊。對抗炎肽的構(gòu)效關系的解析不但可為研究其作用機制提供理論基礎,也可為定向合成、改造、開發(fā)具有活性更佳的多肽類產(chǎn)品提供依據(jù)。

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Research progress in the preparation,isolation,identification and anti-inflammatory mechanism of anti-inflammatory peptides derived from food

WANG Xiong1,ZHAO Yan2,XU Ming-sheng1,YAO Yao1,ZHANG Meng-ya1,TU Yong-gang1,*

(1.Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Food,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China; 2. Engineering Research Centre of Biomass Conversion,Ministry of Education,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Bioactive peptides are one of the hotspots in the area of life and food science. Antimicrobial activity,antihypertensive effect,immune regulation,anti-viral and anti-inflammaroty activity of peptides have gradually been confirmed,but research on anti-inflammatory of peptides is limited. Chronic inflammation seriously affects human health,and the traditional drugs of inflammatory treatment show some side effects. The development and application of food-derived anti-inflammatory peptides is expected to provide new anti-inflammatory strategy for the body inflammatory response. Therefore,this paper reviewed the preparation,purification,identification and molecular mechanism of food-derived anti-inflammatory peptides. Directions for further study and their potential application in practice were also discussed,which provided a reference for further in-depth study of anti-inflammatory peptides derived from food.

food-derived;anti-inflammatory peptide;inflammation;immune;anti-inflammation mechanism

2017-02-20

汪雄(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：生物活性肽，E-mail:945661038@qq.com。

*通訊作者:涂勇剛(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：動物性食品科學理論與技術，E-mail:tygzy1212@aliyun.com。

江西省杰出青年人才資助計劃項目(20162BCB23031)；江西省青年科學家培養(yǎng)對象計劃項目(20153BCB23028)；江西省自然科學基金項目(20171BAB204027)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)15-0335-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.063