季云， 李小琴， 趙婷玲， 孫慶梅， 嚴(yán)凌花， 李莉

臨床與基礎(chǔ)研究

干擾PRMT5表達(dá)肝癌細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立及鑒定

季云， 李小琴， 趙婷玲， 孫慶梅， 嚴(yán)凌花， 李莉

目的探討干擾蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5)表達(dá)肝癌細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立及鑒定。方法針對(duì)PRMT5設(shè)計(jì)出該基因的有效短發(fā)夾RNA(shRNA)片段，選擇合適慢病毒載體，通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建出PRMT5慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA重組載體，并通過PCR以及測(cè)序檢測(cè)構(gòu)建序列的正確性。將重組病毒載體在病毒包裝細(xì)胞中大量生產(chǎn)后，用病毒原液感染PRMT5表達(dá)量相對(duì)較高的SMMC-7721、BEL-7402細(xì)胞，2 d后，用最低殺死濃度的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，得到克隆樣生長的細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后分別提取蛋白和RNA，Western 印跡和qPCR檢測(cè)PRMT5的表達(dá)。結(jié)果成功構(gòu)建出由人源性PRMT5慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA重組載體pLKO.1-sh-PRMT5，PCR及測(cè)序均證明構(gòu)建序列的正確。Western 印跡法和qPCR檢測(cè)，pLKO.1-sh-PRMT5干擾組的PRMT5蛋白及mRNA水平明顯低于pLKO.1-sh-GFP組(P<0.05)，pLKO.1-sh-PRMT5載體具有良好的干擾效果。結(jié)論運(yùn)用慢病毒感染并篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，在干擾效率及經(jīng)濟(jì)角度均優(yōu)越于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，為今后研究PRMT5在肝癌細(xì)胞中作用功能提供了良好的科研工具。

蛋白質(zhì)精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶； RNA； 小分子干擾； 慢病毒屬； 載體蛋白質(zhì)類； 蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5

蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)屬于蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methyltransferases，PRMTs)家族，它能將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)中精氨酸的胍基上[1]。與其他的PRMTs家族成員不同，PRMT5能作用于細(xì)胞內(nèi)不同的蛋白質(zhì)，包括ATP依賴的染色質(zhì)重塑和共抑制因子誘導(dǎo)的基因沉默。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，PRMT5參與細(xì)胞水平的生物學(xué)調(diào)控，如核糖體的合成[2]，高爾基體的組裝[3]，細(xì)胞的分化[4-6]和生殖細(xì)胞的分化[7-8]。越來越多的研究表明，PRMT5與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，PRMT5參與調(diào)控一些主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，繼而影響細(xì)胞死亡和惡性轉(zhuǎn)化[9]。本研究構(gòu)建PRMT5 短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)慢病毒載體，靶向沉默PRMT5基因的水平，包裝慢病毒，感染肝癌細(xì)胞，篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株， 并應(yīng)用Western 印跡和qPCR分別檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中PRMT5基因蛋白和mRNA水平，驗(yàn)證其干擾效率。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇、傳代，含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基預(yù)熱至37 ℃左右，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育(37 ℃、5%CO2)。

1.2 重組慢病毒載體構(gòu)建

據(jù)Sigma官網(wǎng)提供的shRNA序列，設(shè)計(jì)對(duì)照組GFP shRNA干擾序列的引物。

sh-GFP:正向:5-CCGGGCAAGCTGACCCTGAAGT-TCATCTCGAGATGAACTTCAGGGTCACGTTGCTTTTTG-3;反向:5-AATTCAAAAAGCAAGCTGACCCTGAAGT-TCATCTCG-AGATGAACTCAGGGTCACGTTGC-3。

據(jù)Sigma官網(wǎng)提供的shRNA序列，選擇干擾效率達(dá)95%的PRMT5 shRNA干擾序列(此序列干擾PRMT5的3’非編碼端)。sh-PRMT5：正向5’-CCGGGGCTCAAGCCACCAATCTATGCTCGAGCATA GATTGGTGGCTTGAGCCTTTTTG-3’;反向5’-AATTCAAAAAGGCTCAAGCCACCAATCTATGCTCGAGC ATAGATTGGTGGCTTGAGCC-3。shRNA oligos退火，慢病毒骨架質(zhì)粒pLKO.1-TRC雙酶切和膠回收。連接、轉(zhuǎn)化和菌液PCR鑒定，轉(zhuǎn)化連接反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)，設(shè)立對(duì)照組(即雙酶切后的連接產(chǎn)物)，挑多個(gè)單克隆菌落于含有1 ml含Amp的LB的微量離心管內(nèi)，37 ℃，220 r/min細(xì)菌搖床上搖3～4 h，進(jìn)行細(xì)菌擴(kuò)增，以得到的菌液為模板，進(jìn)行菌液PCR鑒定。

上述反應(yīng)體系中引物序列：正向5’-GCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA-3’;反向5’-TGCCATTTGTCTCGAGGTCG-3。

測(cè)序鑒定：將質(zhì)粒郵寄至南京金斯瑞公司進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序引物為GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA。

1.3 包裝病毒

實(shí)驗(yàn)前1天將293T傳代接種于6孔板內(nèi)，接種密度以第2天匯合度達(dá)50%～70%為宜。轉(zhuǎn)染前給細(xì)胞換液(改為不含F(xiàn)BS的 DMEM)，使其饑餓2 h，以提高效率，以6孔板中的1個(gè)孔為例，細(xì)胞接種1×106個(gè)。

pLKO.1-sh-EGFP/pLKO.1-sh-PRMT5質(zhì)粒1μgpsPAX2包裝質(zhì)粒0.75μgpMD2.G穿梭質(zhì)粒0.25μgLipofectamineTM2000/PEI4～6μl無血清培養(yǎng)基100μl

包裝上病毒的293T細(xì)胞生長緩慢，且形態(tài)變圓，培養(yǎng)基顏色變黃，48 h后吸取培養(yǎng)基于新的微量離心管，4 ℃，4 000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞碎片等沉淀，所得的上清液即為病毒上清液，分裝于微量離心管內(nèi)，-80 ℃冰箱保存。

1.4 感染細(xì)胞

取對(duì)數(shù)生長期的SMMC-7721和BEL-7402分別接種6孔板的兩個(gè)孔，細(xì)胞密度為3×106個(gè)/每孔。加病毒原液前換液，使用含聚凝胺的培養(yǎng)基，再分別加入200 μl pLKO.1-sh-PRMT5或pLKO.1-sh-GFP慢病毒原液(聚凝胺的最終濃度為8 μg/ml)，24 h后同樣的方法追加病毒1次。48 h后將培養(yǎng)基換為含嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選(設(shè)立對(duì)照，即未感染病毒的SMMC-7721和BEL-7402)，使用濃度為最低殺死濃度，直至未感染病毒的對(duì)照組細(xì)胞完全被殺死。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)幾代后可見克隆樣細(xì)胞生長，此時(shí)改用低濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。所得到的細(xì)胞株分別為抑制GFP水平的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株sh-GFP以及抑制PRMT5水平的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株sh-PRMT5。

1.5 總RNA提取

用PBS清洗細(xì)胞1～2次，加入1 ml Trizol 裂解細(xì)胞10 min，混勻，按照試劑盒操作步驟提取總RNA，核酸蛋白儀測(cè)定RNA含量及純度，-80 ℃冰箱保存。

1.6 反轉(zhuǎn)錄和qPCR檢測(cè)方法

1.6.1 反轉(zhuǎn)錄 從-80 ℃冰箱取出提取的RNA，冰上融化，根據(jù)Thermo反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。1.6.2 實(shí)時(shí)PCR mRNA PCR引物如下。GAPDH：正向5’-ACCATCTTCCAGGAGCGAGAT-3’，反向5’-ATGACGAACATGGGGGCATC-3’；PRMT5：正向5’-GGACGGAGAAGGGCAGACTA-3’，反向5’-CCCGCATCCAGAACATGGAA-3’。

計(jì)算結(jié)果用2-ΔΔCt表示，ΔCt=Ct(sh-PRMT5)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(sh-PRMT5)-ΔCt(sh-EGFP)。

1.7 Western印跡檢測(cè)方法

1.7.1 蛋白質(zhì)提取 冰上操作：棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗1～2次，加入蛋白裂解液，刮下細(xì)胞于微量離心管中，冰上裂解30 min。在超聲波細(xì)胞破碎儀下超聲裂解細(xì)胞碎片，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，吸取上清置新的微量離心管，置于冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 免疫印跡 配膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉液或5%BSA封閉液室溫封閉1～2 h，一抗孵育，4 ℃孵育過夜。漂洗，TBST漂洗3次，每次10 min。二抗孵育，放入稀釋的二抗(1∶5 000)。室溫下，搖床晃動(dòng)2 h。洗凈二抗后，用濾紙吸干膜上的液體，將ECL發(fā)光液滴入膜上，確保膜各部分受液均勻，在電子凝膠成像系統(tǒng)下，顯影、拍照。

2 結(jié)果

2.1 pLKO.1-TRC質(zhì)粒雙酶切

選取AgeI和EcoRI進(jìn)行載體雙酶切，將產(chǎn)物行瓊脂糖電泳鑒定。結(jié)果顯示：泳道1是15 000 bpDNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；泳道2為pLKO.1-TRC空載質(zhì)粒；泳道3為pLKO.1-TRC空載質(zhì)粒雙酶切成線性的片段。載體被切下了1 500 pb小片段，說明質(zhì)粒pLKO.1-TRC雙酶切成功(圖2A)。

2.2 菌液PCR鑒定重組質(zhì)粒pLKO.1-sh-PRMT5

PRMT5 shRNA oligos退火后與pLKO.1-TRC雙酶切后的產(chǎn)物連接后，轉(zhuǎn)入Stbl3后轉(zhuǎn)化。挑陽性單克隆加入至LB中擴(kuò)增3～4 h，行菌液PCR鑒定。根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物，陽性克隆菌液PCR可獲得257bp DNA片段(圖2B)，泳道2至泳道7無雜帶，且條帶位置正確，提示所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pLKO.1-sh-PRMT5連接成功。

圖2 載體構(gòu)建

2.3 pLKO.1-sh-PRMT5質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

經(jīng)菌液PCR鑒定為陽性克隆，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增后，抽提質(zhì)粒送至南京金斯瑞公司測(cè)序，測(cè)序引物為：GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA。測(cè)序結(jié)果顯示(圖3A、圖3B)，標(biāo)有下劃線部分的序列與本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的PRMT5 shRNA oligo前鏈完全一致，并附此部分序列的測(cè)序峰值圖，由此說明，所構(gòu)建pLKO.1-sh-PRMT5質(zhì)粒正確。

圖3A pLKO.1-sh-PRMT5質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

圖3B pLKO.1-sh-PRMT5質(zhì)粒測(cè)序峰值圖

2.4 檢測(cè)pLKO.1-sh-PRMT5干擾效率

慢病毒包裝后，鏡下細(xì)胞變圓變亮，且培養(yǎng)液由紅轉(zhuǎn)黃。用病毒原液感染PRMT5表達(dá)量相對(duì)較高的SMMC-7721、BEL-7402細(xì)胞2 d后，用最低殺死濃度的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，得到克隆樣生長的細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后分別提取蛋白和RNA，Western 印跡和qPCR檢測(cè)PRMT5的表達(dá)。結(jié)果表明，pLKO.1-sh-PRMT5干擾組的PRMT5蛋白及mRNA水平明顯低于pLKO.1-sh-GFP組(P<0.05)(圖4)。提示pLKO.1-sh-PRMT5載體具有良好的干擾效果。

圖4 shRNA沉默肝癌細(xì)胞株P(guān)RMT5基因的驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

RNAi干擾是近年來日漸成熟的基因沉默技術(shù)，在1998年由Fire等首次提出[10]，它是由雙鏈RNA介導(dǎo)、Dicer酶參與的，能特異、高效地沉默靶向基因[11]。此項(xiàng)干擾技術(shù)在探索生物基因功能、人類傳染性疾病、免疫疾病及腫瘤發(fā)生機(jī)制和治療等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

RNAi干擾技術(shù)是將21～23個(gè)與目的基因同源的外源性核苷酸片段轉(zhuǎn)染至生物體內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)與dsd RNA特異性的RNAase Ⅲ endonuclease酶結(jié)合并誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex，RISC)的形成，RISC以dsd RNA為模板特異地識(shí)別外源性基因表達(dá)的同源基因mRNA，并在結(jié)合部位對(duì)其進(jìn)行剪切，導(dǎo)致被剪切的靶序列mRNA降解，從而抑制該基因的表達(dá)。RNAi技術(shù)能高效特異的阻斷基因的表達(dá)，使靶基因功能喪失或降低基因突變這一特性，使該技術(shù)被廣泛地應(yīng)用到研究基因功能及腫瘤的基因治療領(lǐng)域。

RNAi在實(shí)際應(yīng)用中仍存在許多技術(shù)難題：①因病毒的核酸復(fù)制缺乏嚴(yán)格的堿基修復(fù)系統(tǒng)，易出現(xiàn)堿基突變，影響干擾效果；②在高度折疊或二級(jí)結(jié)構(gòu)中，隱藏在其中某些RNAi序列不被Dicer酶識(shí)別及切割，因此在科研中，常需選擇多個(gè)RNAi序列進(jìn)行驗(yàn)證，才能尋找到理想的siRNA識(shí)別部位[12]；③siRNA轉(zhuǎn)染效率低是科研技術(shù)上的難題[13]，但近年來基因技術(shù)日益成熟，轉(zhuǎn)染效率有所突破；④siRNA轉(zhuǎn)染效率低、時(shí)效性短(48 h后即開始降解)、穩(wěn)定性差。近年來，科研研究者們已成功的設(shè)計(jì)出一種shRNAi技術(shù)[11-12]，且該技術(shù)目前已較為成熟。在此基礎(chǔ)上，借助慢病毒載體，通過病毒干擾生物體提高了轉(zhuǎn)染效率及穩(wěn)定性，可長期的穩(wěn)定的表達(dá)，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，shRNA更占優(yōu)勢(shì)[14]。因此，我們采用慢病毒載體與短發(fā)夾RNA技術(shù)，克服傳統(tǒng)siRNA弊端，在干擾效率及經(jīng)濟(jì)角度考慮均優(yōu)越于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，為今后研究PRMT5在肝癌細(xì)胞中作用功能提供了良好的科研工具。

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EstablishmentandidentificationofPRMT5transfectedhepatocellularcarcinomacellline

JIYun,LIXiaoqin,ZHAOTingling,SUNQingmei,YANLinghua,LILi.

(DepartmentofChemotherapy,CancerCenter,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China)

JIYun,Email:jy751121@163.com

ObjectiveTo investigate the establishment and identification of a stable cell line expressing protein arginine methyltransferase 5(PRMT5) interference in hepatocellular carcinoma cells.MethodsThe effective short hairpin RNA(shRNA) fragment of the PRMT5 gene was designed, By selecting the suitable lentiviral vector, the recombinant vector of PRMT5 lentiviral vector mediated by shRNA was constructed by gene engineering technology. The correctness of the sequence was detected by PCR and sequencing. Recombinant viral vectors were produced in a large number in viral packaging cells. SMMC-7721 and BEL-7402 cells with high expression of PRMT5 were infected with virus solution for 2 d. The cells presented with clone-like growth were cloned by using the minimum kill concentration of puromycin. The expression of PRMT5 was detected by Western blotting and qPCR after extracting the protein and RNA.ResultsShRNA recombinant vector pLKO.1-sh-PRMT5 was successfully constructed by human derived PRMT5 lentiviral vector, and the sequence of PCR was proved to be correct. Western blotting and qPCR detection showed that the expressions of PRMT5 and mRNA in the pLKO.1-sh-PRMT5 interference group were significantly lower than those of the pLKO.1-sh-GFP group(P< 0.05). pLKO.1-sh-PRMT5 vector had good interference effect of PRMT5 protein.ConclusionsThe lentiviral vector which used to screen the stable cell line, was superior to the transient transfection in the interference efficiency and economic point of view, which provided a good research tool for studying the function of PRMT5 in hepatoma cells in the future.

Protein-arginine N-methyltransferases; RNA; Small interfering; Lentivirus; Carrier proteins; Protein arginine methyltranserase 5

212001 江蘇 鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤治療中心 化療科

季云，Email：jy751121@163.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.03.014

1674-4136(2017)03-0186-05

2016-09-02][本文編輯：李慶]