李 恒，陳丹妮，于郭寶平

1)深圳大學(xué)光電工程學(xué)院，光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室，廣東深圳 518060；2)深圳大學(xué)信息工程學(xué)院，廣東深圳 518060

【光電工程/OptoelectronicEngineering】

DH-PSF三維動態(tài)多粒子追蹤在活細(xì)胞成像的應(yīng)用

1)深圳大學(xué)光電工程學(xué)院，光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室，廣東深圳 518060；2)深圳大學(xué)信息工程學(xué)院，廣東深圳 518060

利用雙螺旋點擴(kuò)散函數(shù)三維定位的能力建立了三維多粒子追蹤成像系統(tǒng)，成像深度可達(dá)到4 μm，定位精度達(dá)到20 nm，并在該系統(tǒng)上實現(xiàn)了對巨噬細(xì)胞內(nèi)多個熒光微球的動態(tài)追蹤．結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)熒光探針的運動范圍達(dá)到7 μm，可實時獲取熒光微球在細(xì)胞內(nèi)的運動速率，研究表明該系統(tǒng)是生物學(xué)家研究細(xì)胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)運和相互關(guān)系非常有用的工具．

光學(xué)工程；三維成像；多粒子；點擴(kuò)展函數(shù)；納米定位；活細(xì)胞；動態(tài)追蹤

細(xì)胞是生命體最基本的單元，其功能與細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)變化以及細(xì)胞內(nèi)生物分子的動態(tài)變化密切相關(guān)，只有理解細(xì)胞在生命過程中分子機(jī)制的交互作用，才能深入了解生命活動的本質(zhì)[1]．顯微鏡的誕生使得科學(xué)家對于細(xì)胞微觀信息的獲取成為可能，從發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識細(xì)胞，到闡明細(xì)胞的周期循環(huán)和凋亡規(guī)律等方面，顯微鏡都具有重大的推動作用．然而，傳統(tǒng)顯微鏡已經(jīng)無法滿足人類對了解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等生物大分子功能的需求，生物分子在細(xì)胞內(nèi)的運轉(zhuǎn)，以及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的相互作用關(guān)系等一系列在體活動，目前也無法通過生物物理實驗方法來實現(xiàn)，致使活細(xì)胞的研究陷入瓶頸[2]．

近年來，隨著激光技術(shù)、熒光材料制備、熒光標(biāo)記和圖像處理等技術(shù)的快速發(fā)展[3]，以及高性能探測器件的不斷涌現(xiàn)，光學(xué)顯微技術(shù)進(jìn)入嶄新的發(fā)展階段[4-6]．新一代的光學(xué)顯微鏡以其所具有的高時空分辨率、無損傷以及對活細(xì)胞單分子探測的可行性等優(yōu)點，成為生物學(xué)家的研究熱點[7-9]．隨著超分辨顯微成像技術(shù)的快速發(fā)展，實現(xiàn)納米級定位精度的成像方法層出不窮，這些方法多是基于二維定位或者成像深度較低，活細(xì)胞成像多采用掃描方式實現(xiàn)[10-17]，會限制活細(xì)胞的成像應(yīng)用．

巨噬細(xì)胞是免疫細(xì)胞的一種，具有調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)的作用，通過吞噬凋亡細(xì)胞、殺滅微生物、抗原呈遞和分泌細(xì)胞因子等對機(jī)體炎癥和免疫應(yīng)答進(jìn)行的調(diào)控．大量的研究主要集中在巨噬細(xì)胞的識別與吞噬上, 但對巨噬細(xì)胞吞噬的動態(tài)過程及吞噬后在胞內(nèi)運動軌跡的研究還比較少[18]．本研究通過特殊設(shè)計的三維超分辨成像方法，得到4μm厚度的超分辨動態(tài)成像，實現(xiàn)了巨噬細(xì)胞內(nèi)吞的實時記錄，為生物學(xué)研究提供非常有用的工具．

1 成像原理

采用雙螺旋點擴(kuò)展函數(shù)方法實現(xiàn)三維超分辨成像，雙螺旋點擴(kuò)展函數(shù)就是利用拉蓋爾-高斯模式(Laguerre-Gauss，LG)組合疊加形成，具有自成像的現(xiàn)象，其函數(shù)橫截面為雙螺旋形，隨系統(tǒng)軸向位置發(fā)生旋轉(zhuǎn)而不散焦，通過所形成雙螺旋點的旋轉(zhuǎn)角度就可以精確記錄三維位置[19-20]．

原始的雙螺旋點擴(kuò)展函數(shù)是由LG模式的復(fù)振幅疊加形成，由此所產(chǎn)生的雙螺旋形式也是復(fù)振幅形式，因此會造成大量的光能吸收使光能利用率非常低，以及產(chǎn)生雙螺旋點的雜散光影響較大等問題，使之無法用于活細(xì)胞的三維成像當(dāng)中．在前期工作中利用優(yōu)化迭代算法對雙螺旋點擴(kuò)展函數(shù)進(jìn)行改造，以此獲得具有高效的雙螺旋點擴(kuò)展函數(shù)模型(double helix point spread function,DH-PSF)[21]．

基于前期相位片的制備，利用DH-PSF搭建了具有三維超分辨能力的成像系統(tǒng)，如圖1(a)．相位片設(shè)計參數(shù)基于100倍物鏡而定，物鏡的數(shù)值孔徑(numerical aperture，NA)為1.4．選擇產(chǎn)生熒光中心波長λ=550nm，孔徑通光直徑D=5mm，像素化后像素數(shù)336×336，像素大小為16μm，DH-PSF螺旋點旋轉(zhuǎn)180°后對應(yīng)的軸向距離范圍為4μm．由此實現(xiàn)成像系統(tǒng)的搭建，利用Olympus81倒置熒光顯微鏡為基礎(chǔ)，選擇浸油物鏡(NA=1.4，100×)，激發(fā)光波長為488nm，激光光束經(jīng)過擴(kuò)束準(zhǔn)直光路后由物鏡激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光，由物鏡收集后經(jīng)過管鏡(fTL2=180mm)，通過一組4F系統(tǒng)(透鏡1和透鏡2)，相位片放于傅里葉面位置，最終信號經(jīng)過4F系統(tǒng)成像到探測器上．

圖1 基于DH-PSF三維成像原理Fig.1 Principle of three-dimensional imaging based on DH-PSF

為更好利用雙螺旋點擴(kuò)展函數(shù)實現(xiàn)三維定位，需要對該方式進(jìn)行標(biāo)定，以確定系統(tǒng)所能達(dá)到的成像深度以及所在位置的定位精度信息．標(biāo)定選擇100nm熒光微球(Thermo-Fisher公司，型號T8864，其激發(fā)波長與發(fā)射波長為EX/EM=488nm/560nm)作為顯微成像目標(biāo)，激光出射功率約10mW；電子倍增式電荷耦合裝置(electron multiplying charge coupled device, EMCCD)探測器像元大小為8μm×8μm，制冷溫度為-70℃，單幅曝光時間為30ms，所獲得圖像總光子數(shù)約為5000，結(jié)合納米位移臺樣品步進(jìn)，每一個步進(jìn)位置采集100幅數(shù)，步進(jìn)量設(shè)定為100nm，得到在不同z向位置處的雙螺旋點圖像，如圖1(b)所示，所形成的光斑近似為雙高斯形態(tài)對稱分布，由此利用雙高斯函數(shù)進(jìn)行擬合，

其中，A1和A2為兩個旁瓣的幅值； (μx1，μy1)和(μx2，μy2)分別為兩個旁瓣的橫向位置信息；σ1和σ2為2個旁瓣的標(biāo)準(zhǔn)差．通過數(shù)據(jù)擬合得到在各z軸位置處所對應(yīng)的橫向位置信息，并由此可以獲得相應(yīng)的旋轉(zhuǎn)角度，其中，2個旁瓣所對應(yīng)位置的連線中心定義為實際橫向位置，而旁瓣連線與水平方向的夾角則與z軸步進(jìn)一一對應(yīng)，因此利用上述系統(tǒng)可以得到在整個軸向位置所對應(yīng)的角度信息，如圖2(a)所示．而每一個軸向位置處所對應(yīng)的(x,y,z)方向的定位精度是通過重復(fù)采集該位置處的位置信息統(tǒng)計所得，其結(jié)果如圖2(b)所示．

圖2 DH-PSF系統(tǒng)標(biāo)定結(jié)果Fig.2 Calibration results of DH-PSF system

2 基于DH-PSF的動態(tài)追蹤成像

巨噬細(xì)胞作為免疫細(xì)胞具有對多種刺激快速反應(yīng)的能力，利用該反應(yīng)可以快速獲取巨噬細(xì)胞的胞內(nèi)反應(yīng)過程，巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞表現(xiàn)為：按照吞噬物進(jìn)入溶酶體的途徑，由巨噬細(xì)胞識別異物后，伸出偽足包裹，細(xì)胞表面膜產(chǎn)生內(nèi)陷，攝入到細(xì)胞內(nèi)形成吞噬體，吞噬體由微管向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移中與溶酶體融合形成吞噬溶酶體，而異物在吞噬溶酶體中會通過氧依賴機(jī)制或者氧非依賴機(jī)制被消化或者殺滅，最終不能消化的病原或異物則會被排出胞外[18]．實驗以巨噬細(xì)胞(型號為Raw)為對象，同時采用40nm熒光微球(ThermoFisher公司，型號為T8864，EX/EM=488nm/560nm)作為標(biāo)記物．巨噬細(xì)胞對于外來的異物選擇相對盲目，因此當(dāng)異物到達(dá)細(xì)胞附近，巨噬細(xì)胞就會形成內(nèi)吞現(xiàn)象．

具體處理過程如下：

1)細(xì)胞培養(yǎng)：巨噬細(xì)胞種于培養(yǎng)皿上，注入含有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清(fetal calf serum, FBS)酚紅(dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)培養(yǎng)液使其生長，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，CO2體積分?jǐn)?shù)5%，細(xì)胞狀態(tài)以細(xì)胞密度及細(xì)胞貼壁狀態(tài)為準(zhǔn)．

2)標(biāo)記物制備：熒光微球用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)稀釋100倍，超聲震蕩避免熒光珠團(tuán)聚．

3) 細(xì)胞清洗及處理：37℃ PBS清洗2遍后加入2mL的37℃活細(xì)胞成像緩沖液．

4)細(xì)胞成像：顯微鏡樣品臺加裝恒溫系統(tǒng)，培養(yǎng)皿加入稀釋標(biāo)記物液后立即觀察成像．

按照上述步驟對細(xì)胞處理并進(jìn)行活細(xì)胞實驗，觀察結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞具有不同的動態(tài)情況．圖3(a)為白光照明下的細(xì)胞形態(tài)，圖3(b)為暗場情況下熒光圖像序列，黃色線條是為了識別細(xì)胞輪廓勾勒出的，視場顯示兩個細(xì)胞A和B，熒光微球在培養(yǎng)液中做布朗運動，當(dāng)吸附到細(xì)胞膜上之后會產(chǎn)生相應(yīng)的吞噬反應(yīng)，由熒光圖像可以觀察到熒光微球在細(xì)胞膜以及細(xì)胞內(nèi)部的不同運動形式，圖像中細(xì)胞A和B分別可見熒光微球量較少．分別捕捉到熒光微球在細(xì)胞的變化，其中，熒光微球1(A(1))和3(B(3))分別沿膜表面產(chǎn)生疑似跨膜運動，成像記錄到在膜位置處的微動；熒光微球2(A(2))和4(B(4))則在細(xì)胞內(nèi)部有大范圍移動，其他的微球則在細(xì)胞內(nèi)多呈微動狀態(tài)，圖像記錄到微球在細(xì)胞內(nèi)運動的全部過程．

圖3 Raw細(xì)胞圖像Fig.3 Raw cell image

分析圖像序列，將所得到的雙螺旋點進(jìn)行擬合定位，利用模式匹配的方法實現(xiàn)圖像重構(gòu)，以此獲取熒光微球在三維位置的精確定位，如圖4，色條表示按照時間序列熒光微球的運動軌跡．

圖4 三維重構(gòu)圖像結(jié)果Fig.4 3D image reconstruction results

熒光微球在整個三維空間的定位信息被獲取，因此，所在位置處的移動量以及相應(yīng)時刻的移動速率亦可計算獲得，如圖5．相應(yīng)的表示細(xì)胞A和B上分別標(biāo)記的4個熒光微球在對應(yīng)時刻的移動量(I)和運動速率(II)．計算分析結(jié)果，熒光微球在細(xì)胞內(nèi)能達(dá)到7μm移動量，在細(xì)胞內(nèi)的運動速率最大為3μm/s，同時在細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)時間維持在30～60s．

圖5 熒光微球移動量(I)和運動速率(II)統(tǒng)計Fig.5 Statistics of the motion (I) and rate (II) of fluorescent microspheres

(續(xù)圖5)

圖5 熒光微球移動量(I)和運動速率(II)統(tǒng)計Fig.5 Statistics of the motion (I) and rate (II) of fluorescent microspheres

結(jié) 語

完整活細(xì)胞實現(xiàn)多粒子定位追蹤對于超分辨成像在活體細(xì)胞的應(yīng)用是非常大的挑戰(zhàn)，通過DH-PSF方法將點擴(kuò)展函數(shù)改造成雙螺旋的形式，在4μm軸向范圍內(nèi)產(chǎn)生連續(xù)旋轉(zhuǎn)，且不會散焦的光斑，利用雙高斯擬合方法實現(xiàn)所形成光斑的三維信息位置獲取，通過計算分析能夠得到約20nm左右的定位精度，且可用于三維方向的多粒子追蹤，為細(xì)胞內(nèi)大分子運動規(guī)律的研究提供有利工具．本研究通過上述方法對巨噬細(xì)胞進(jìn)行成像，通過該系統(tǒng)成功得到在活細(xì)胞狀態(tài)下，同時記錄多個熒光微球在巨噬細(xì)胞內(nèi)的各種不同運動軌跡和實時數(shù)據(jù)結(jié)果，下一步工作中還將結(jié)合單分子定位方法同時獲得細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)，以此將實現(xiàn)細(xì)胞的全功能信息提?。?/p>

致謝：衷心感謝屈軍樂教授的悉心指導(dǎo)!

/

：

[1] Xie X S, Yu J, Yang W Y. Living cells as test tubes[J]. Science,2006,312(5771):228-230.

[2] 牛憨笨,陳丹妮,尹 君.細(xì)胞內(nèi)分子檢測及成像技術(shù)研究[J].深圳大學(xué)學(xué)報理工版,2011,28(1):1-16. Niu Hanben,Chen Danni, Yin Jun.Advances in approaches of molecules detecting and imaging in cells[J].Journal of Shenzhen University Science and Engineering,2011,28(1):1-16.(in Chinese)

[3] 許改霞,楊堅泰,Roy Indrajit,等.納米顆粒在穿透血腦屏障研究中的應(yīng)用[J].深圳大學(xué)學(xué)報理工版,2009,26(1):1-8. Xu Gaixia,Yang Kentye,Roy Indrajit,et al.The application of nanoparticle in BBB transmigration[J].Journal of Shenzhen University Science and Engineering,2009,26(1):1-8.(in Chinese)

[4] Ober R J, Ram S, Ward E S. Localization accuracy in single-molecule microscopy[J]. Biophysical Journal,2004,86(2):1185-1200.

[5] Hess S T, Girirajan T P K, Mason M D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy[J]. Biophysical Journal,2006,91(11):4258-4272.

[6] Rust M J, Bates M, Zhuang X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM)[J]. Nature Methods,2006,3(10):793-796.

[7] 邵永紅,李 恒,王 巖,等.基于同步掃描相機(jī)的熒光壽命測量系統(tǒng)研究[J].深圳大學(xué)學(xué)報理工版,2009,26(4):331-336. Shao Yonghong, Li Heng,Wang Yan,et al.A fluorescence lifetime spectrometer based on a synchroscan streak camera[J].Journal of Shenzhen University Science and Engineering,2009,26(4):331-336.(in Chinese)

[8] Vo-Dinh T, Masters B R. Biomedical photonics handbook[J]. Journal of Biomedical Optics,2004,9(5):1110-1111.

[9] Mizushima N, Levine B. Autophagy in mammalian development and differentiation[J]. Nature Cell Biology,2010,12(9):823-830.

[10] 陳丹妮,于 斌,劉 夏,等.基于數(shù)字微鏡裝置的結(jié)構(gòu)光照明層析成像[J].深圳大學(xué)學(xué)報理工版,2008,25(4):376-380. Chen Danni,Yu Bin,Liu Xia,et al.Sectioned imaging of DMD-based structured illumination fluorescence microscopy[J].Journal of Shenzhen University Science and Engineering,2008,25(4):376-380.(in Chinese)

[11] Huang B, Wang W, Bates M, et al. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy[J]. Science,2008,319(5864):810-813.

[12] Juette M F, Gould T J, Lessard M D, et al. Three-dimensional sub-100nm resolution fluorescence microscopy of thick samples[J]. Nature Methods,2008,5(6):527-529.

[13] Pavani S R P, Piestun R, Thompson M A, et al. Three-dimensional super-resolution imaging with a double-helix microscope[C]// Proceedings Advances in Imaging. Vancouver,Canada: OSA Publishing,2009.

[14] Herbert S, Soares H, Zimmer C, et al. Single-molecule localization super-Resolution microscopy: deeper and faster[J]. Microscopy and Microanalysis,2012,18(6):1419-1429.

[15] Ram S, Kim D, Ober R J, et al.3D single molecule tracking with multifocal plane microscopy reveals rapid intercellular transferrin transport at epithelial cell barriers[J]. Biophysical Journal,2012,103(7):1594-1603.

[16] Abrahamsson S, Chen J, Hajj B, et al. Fast multicolor3D imaging using aberration-corrected multifocus microscopy[J]. Nature Methods,2013,10(1):60-63.

[17] Chen Danni, Yu Bin, Li Heng, et al. Approach to multiparticle parallel tracking in thick samples with three-dimensional nanoresolution[J]. Optics Letters,2013,38(19):3712-3715.

[18] 王 炯, 黃維琳, 汪 誠, 等. 巨噬細(xì)胞吞噬凋亡中性粒細(xì)胞及吞噬誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡的實時動態(tài)觀察[J]. 中國科學(xué): 生命科學(xué),2014,44(6):571-577. Wang Jiong, Huang Weilin, Wang Cheng, et al. Dynamic process of phagocytosis and fates of macrophages after their ingestion of apoptotic neutrophils[J]. Scientia Sinica Vitae,2014,44(6):571-577.(in Chinese)

[19] Schechner Y Y, Piestun R, Shamir J. Wave propagation with rotating intensity distributions[J]. Physical Review E,1996,54(1):50-53.

[20] Piestun R, Schechner Y Y, Shamir J. Propagation-invariant wave fields with finite energy[J]. JOSA A,2000,17(2):294-303.

[21] 李 恒, 于 斌, 陳丹妮, 等. 高效雙螺旋點擴(kuò)展函數(shù)相位片的設(shè)計與實驗研究[J]. 物理學(xué)報,2013,62(12):124201. Li Heng, Yu Bin, Chen Danni,et al. Design and experimental demonstration of high-efficiency double-helix point spread function phase plate[J].Acta Physica Sinica,2013,62(12):124201.(in Chinese)

【中文責(zé)編：方圓；英文責(zé)編：木南】

ApplicationofDH-PSFthree-dimensionaldynamicmulti-particletrackingmethodinlivingcellimaging

1)CollegeofOptoelectronicEngineering,KeyLaboratoryofOptoelectronicDevicesandSystemsofMinistryofEducationandGuangdongProvince,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,GuangdongProvince,P.R.China2)CollegeofInformationEngineering,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,GuangdongProvince,P.R.China

Multi-particle tracking is one of the most challenging aspects of living cell imaging. We establish a three-dimensional multi-particle tracking imaging system based on three-dimensional positioning of double helix point spread function.The imaging depth and localization precision can achieve4μm and20nm, respectively. The result of dynamic tracking of fluorescence microspheres in Raw cells shows that the detectable trajectory range of intracellular moleculesis could be up to7μm and the velocity of probes could be obtained in real time. Therefore, this system is a very useful tool for studying the intermolecular interaction in living cell.

optical engineering; three-dimensional imaging; multi-particle; point spread function; nano-posi-tioning; living cell; dynamic tracking

2017-04-07；Accepted：2017-05-27

Associate professor Chen Danni．E-mail: dannyc007@163.com

Q 63；O 437

：Adoi：10.3724/SP.J.1249.2017.05526

Foundation：National Natural Science Foundation of China ( 61605127); Natural Science Foundation of Guangdong Province (2014A030312008); Shenzhen Science and Technology Research Foundation (JCYJ20150324141711698, JCYJ20160308104404452)

：Li Heng, Chen Danni, Yu Bin, et al．Application of DH-PSF three-dimensional dynamic multi-particles tracking method in living cell imaging[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(5): 526-531.(in Chinese)

國家自然科學(xué)基金資助項目(61605127)；廣東省自然科學(xué)基金資助項目(2014A030312008)；深圳市科技計劃資助項目(JCYJ20150324141711698, JCYJ20160308104404452)

李 恒(1985—)，男，深圳大學(xué)博士后研究人員．研究方向：超分辨成像．E-mail：liheng@email.szu.edu.cn

引文：李 恒，陳丹妮，于 斌，等.DH-PSF三維動態(tài)多分子追蹤在活細(xì)胞成像的應(yīng)用[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報理工版，2017，34(5)：526-531.