周林宗+張倫+楊申明+王振吉+羅亞仙

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.042[HT9.]

摘要：以刺槐花為材料，優(yōu)化超聲波輔助提取總黃酮的工藝，并測定其總黃酮的抗氧化性。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為指標(biāo)，通過正交試驗優(yōu)化其總黃酮的提取工藝參數(shù)，并通過刺槐花總黃酮對1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]）的清除來評價其抗氧化能力。結(jié)果表明，最佳提取工藝參數(shù)為：超聲溫度45 ℃、超聲時間70 min、料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，在該條件下總黃酮平均提取率為28.69%，RSD值為0.72%；總黃酮質(zhì)量濃度為0.47 mg/mL時，對DPPH·、·OH、 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的清除率分別達到88.04%、34.41%、59.07%，表明刺槐花總黃酮具有較強的抗氧化性。

關(guān)鍵詞：刺槐花；超聲輔助提取；總黃酮；抗氧化性

中圖分類號： R284.2文獻標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0146-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2017-01-06

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31300370）；云南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃（編號：IRTSTYN）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（編號：2014FD052）；楚雄師范學(xué)院學(xué)術(shù)骨干項目（編號：13XJGG03）；楚雄師范學(xué)院教改項目（編號：1510）。

作者簡介：周林宗（1962—），男，云南楚雄人，副教授，從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究及教學(xué)工作。E-mail：ysm@cxtc.edu.cn。

通信作者：張倫，博士，講師，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：cxzhanglun@cxtc.edu.cn。

[ZK）]

刺槐（Robinia pseudoacacia L.）別稱洋槐，為豆科蝶形花亞科刺槐屬多年生落葉喬木或灌木[1]。刺槐產(chǎn)花量較大，花中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素、黃酮類化合物和揮發(fā)油等，花可炒食作野菜食用，也可入藥使用，具有較高的食用價值和藥用價值[2]。在民間，刺槐花用于治療大腸下血、咯血、吐血、婦女紅崩等病癥。我國刺槐花資源豐富，但其利用率低，除少量被食用和藥用外，大部分刺槐花落地荒棄。因此，從刺槐花中提取有效成分并對其進行開發(fā)利用具有重要意義。

目前，對刺槐花的研究主要集中在成分分析[2-4]、藥理作用[5-6]、食品加工[7-9]等方面。近年來，對刺槐花中黃酮類化合物的研究正引起有關(guān)學(xué)者的高度關(guān)注。王嵐等采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析法從刺槐花中鑒定出11種黃酮苷[10]，李艷艷等采用乙醇回流法對刺槐花總黃酮的提取工藝進行了研究[11]，向昌國等采用響應(yīng)面法對刺槐花黃酮類化合物的微波提取工藝進行了研究[12]，但采用超聲波輔助提取刺槐花總黃酮的工藝化化及抗氧化性研究鮮見報道。本試驗以刺槐花為材料，采用超聲輔助從刺槐花中提取總黃酮，通過正交試驗對提取工藝條件進行優(yōu)化。同時，以維生素C為對照，并對所提取的總黃酮從清除1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O-2[KG-*2]· [KG-*3]）的能力3個方面評價其抗氧化性，旨在為更好地開發(fā)和利用刺槐花中黃酮類物質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

刺槐花采自楚雄師范學(xué)院校園內(nèi)，經(jīng)鑒定為豆科蝶形花亞科刺槐屬植物；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC﹥98%）由中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，1，1-苯基-2-苦肼基自由基由上海藍季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，其他所用化學(xué)試劑均為分析純，由天津市風(fēng)船化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

1.2儀器與設(shè)備

α-1502紫外可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司；SHZ-Ⅲ A型循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SK8210HP型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市大地自動化儀器廠；CP224C型電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司；DG-111型電熱干燥箱，威瑞科教儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1刺槐花總黃酮的提取

將新鮮刺槐花洗凈風(fēng)干后置于55 ℃干燥箱中烘干，粉碎后過60目得刺槐花干粉，備用。準(zhǔn)確稱取1.0 g刺槐花干粉，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，設(shè)定一定超聲溫度，水浴一定時間，其間進行超聲波（功率 500 W）輔助提取，提取完畢后，將提取液減壓抽濾，收集濾液，所得濾渣再次用上述方法提取，合并2次濾液定容至 50 mL 容量瓶中，得供試品溶液。

1.3.2總黃酮含量的測定

1.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

參考文獻[13]的方法，稍作修改。精確吸取0、1、2、3、4、5 mL質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于25 mL比色管中，各加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻；放置5 min后，各加入10%硝酸鋁溶液 1.0 mL，搖勻；放置5 min后，再各加入4%氫氧化鈉溶液 5.0 mL，最后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液稀釋至25 mL，搖勻，放置10 min。以蒸餾水為空白對照，在波長510 nm處分別測其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、蕓香苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程，為D=1.073C+0.573 5。式中：D為吸光度；C為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mg/mL；相關(guān)系數(shù) r2=0.999 77。

1.3.2.2總黃酮提取率的計算

準(zhǔn)確吸取2.0 mL供試品溶液于25 mL的比色管中，按“1.3.2.1”節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備操作方法，在波長510 nm處測定吸光度，平行測定3次，結(jié)果取平均值。刺槐花總黃酮的提取率計算公式為：endprint

[JZ]總黃酮提取率=[SX（]C×N×V×0.001m[SX）]×100%。

式中：C為所測溶液的吸光度值帶入回歸方程計算出的總黃酮類化合物的質(zhì)量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液定容的體積，mL；m為刺槐花粉末的質(zhì)量，g。

1.3.3單因素試驗設(shè)計

考察超聲溫度、時間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)等4個單因素的影響。（1）超聲溫度采用40、45、50、55、60 ℃的條件下進行比較，超聲時間60 min，料液比 1 g ∶[KG-*3]30 mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%；（2）超聲時間采用40、50、60、70、80 min的條件下進行比較，超聲溫度50 ℃，料液比 1 g ∶[KG-*3]30 mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%；（3）料液比采用1 ∶[KG-*3]20、1 ∶[KG-*3]25、1 ∶[KG-*3]30、1 ∶[KG-*3]35、1 ∶[KG-*3]40（g ∶[KG-*3]mL） 的條件下進行比較，超聲溫度50 ℃，超聲時間60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%；（4）乙醇體積分?jǐn)?shù)采用50%、60%、70%、80%、90%的條件下進行比較，超聲溫度50 ℃，超聲時間60 min，料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL，從而確定乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響作用。

1.3.4正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇超聲溫度、超聲時間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)進行4因素3水平做 L9（34） 正交試驗優(yōu)化提取條件，因素水平設(shè)計見表1。

1.3.5刺槐花總黃酮抗氧化活性測定

將超聲波輔助提取得到的刺槐花總黃酮溶液分別配制成0.03、0.14、0.25、0.36、0.47 mg/mL等5種不同質(zhì)量濃度，研究其抗氧化性。

1.3.5.1清除DPPH·能力測定參照文獻[14]的方法測定刺槐花總黃酮溶液對DPPH·的清除能力。向2.5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液中分別加1 mL不同質(zhì)量濃度的刺槐花總黃酮溶液，混合反應(yīng)30 min，在波長517 nm處用分光光度計測吸光度，記為Di；同時測2.5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液與1.0 mL無水乙醇混合液的吸光度（Dc），及2.5 mL無水乙醇與不同質(zhì)量濃度的1 mL刺槐花總黃酮溶液混合液的吸光度（Db）。以維生素C為陽性對照，刺槐花總黃酮對DPPH·清除率計算公式為：

[JZ]DPPH·清除率=（1-[SX（]Di-DbDc[SX）]）×100%。

1.3.5.2清除·OH能力測定參照文獻[15]的方法測定刺槐花總黃酮對·OH的清除能力。取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的刺槐花總黃酮溶液置于5支比色管中，分別加入 9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmoL/L水楊酸-乙醇溶液和 8.8 mmol/L H2O2溶液各2.0 mL，最后加蒸餾水定容至 10 mL，在37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min后，在波長510 nm處用分光光度計測吸光度。同時，以維生素C為陽性對照，刺槐花總黃酮對·OH清除率，計算公式為：

[JZ]·OH清除率=[SX（]D0-（DX-DX0）D0[SX）]×100%。

式中：D0為刺槐花總黃酮溶液的空白對照溶液的吸光度；DX為加過氧化氫刺槐花總黃酮溶液的吸光度；DX0為不加過氧化刺槐花總黃酮溶液的吸光度。

1.3.5.3清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]能力測定參照文獻[13]的方法測定刺槐花總黃酮溶液對 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的清除能力。在5支25 mL比色管中加入不同質(zhì)量濃度的刺槐花總黃酮溶液1.0 mL，再依次加入4.5 mL Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH值=8.2）、3.2 mL超純水，混勻后在25 ℃水浴中恒溫反應(yīng)20 min，取出后迅速加入25 ℃水浴中預(yù)熱好的0.3 mL鄰苯三酚溶液（3 mmol/L），以0.3 mL鹽酸（10 mmol/L）代替作參比，混勻后迅速在波長325 nm處每隔30 s測1次吸光度，直到5 min時停止。計算刺槐花總黃酮溶液的吸光度隨時間的變化率，記為Fx；取1支25 mL比色管不加刺槐花總黃酮溶液，按上述加入試劑量后，按上述方法測定吸光度，計算空白液的吸光度隨時間的變化率記為F0。同時，以維生素C為陽性對照，刺槐花總黃酮對 O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率計算公式為：

[JZ] O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率=[SX（]F0-FXFX[SX）]×100%。

2結(jié)果與分析

2.1超聲溫度對刺槐花總黃酮提取效果的影響

由圖1-a可知，在超聲溫度為40～50 ℃范圍內(nèi)，隨著超聲溫度的升高，總黃酮提取率增大，當(dāng)超聲溫度升高到50 ℃時，提取率達到最大，為27.98%；之后隨超聲溫度的繼續(xù)升高，刺槐花總黃酮提取率呈下降趨勢。這可能是隨著超聲溫度的升高，總黃酮在乙醇溶液中的溶解度增加，同時由于溫度升高，分子運動加快，擴散速率增加，促使提取速度加快[16]。但超聲提取溫度過高，會破壞部分黃酮類化合物結(jié)構(gòu)并增加其他非黃酮類物質(zhì)溶出，影響黃酮類物質(zhì)的活性和提取率。因此，確定適宜的超聲溫度在50 ℃附近，選擇45、50、55 ℃等3個水平超聲溫度進行正交試驗。

2.2超聲時間對刺槐花總黃酮提取效果的影響

由圖1-b可知，隨著超聲時間的延長，刺槐花總黃酮提取率逐步增大，當(dāng)超聲時間為60 min時，提取率達到最大，為27.93%；之后再延長超聲時間，刺槐花總黃酮提取率呈下降趨勢。這說明刺槐花總黃酮的提取過程與超聲時間密切相關(guān)，超聲時間較短，提取不充分，超聲時間過長又會造成刺槐花中非黃酮類物質(zhì)的大量溶出，導(dǎo)致提取率下降。因此，確定適宜的超聲時間在60 min附近，選取超聲時間50、60、70 min等3個水平進行正交試驗。endprint

2.3料液比對刺槐花總黃酮提取效果的影響

由圖1-c可知，隨著溶劑用量的增加，刺槐花中總黃酮提取率增大，但隨著溶劑用量的進一步增加，對提取率增加的效果逐步減小，同時提取成本進一步增大，當(dāng)料液比為 1 g ∶[KG-*3]30 mL時，提取率達到最大，為27.48%；之后隨著溶劑用量的進一步增大，刺槐花總黃酮提取率呈下降趨勢。因此，確定適宜的料液比在1 g ∶[KG-*3]30 mL附近，選取料液比 1 ∶[KG-*3]25、1 ∶[KG-*3]30、1 ∶[KG-*3]35（g ∶[KG-*3]mL） 3個水平進行正交試驗。

2.4乙醇體積分?jǐn)?shù)對刺槐花總黃酮提取效果的影響

由圖1-d分析可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%范圍內(nèi)，總黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，提取率達到最大（27.86%），之后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增大，提取率呈下降趨勢。這可能是在低濃度乙醇下，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增大，醇溶性物質(zhì)的溶出量增加，提取率開始呈現(xiàn)增大的趨勢；但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的進一步增大，刺槐花中的一些醇溶性和脂溶性的雜質(zhì)溶出量也逐漸增多，這些成分可能會與乙醇—水分子體系結(jié)合，與黃酮類化合物形成競爭，影響刺槐花黃酮類物質(zhì)的溶出，導(dǎo)致總黃酮提取率下降[17]。因此，確定適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%附近，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、70%、80%等3個水平進行正交試驗。

2.5正交試驗結(jié)果

從表2分析可知，對刺槐花總黃酮提取率的影響因素由大到小為超聲溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>超聲時間。由極差分析得到最佳提取工藝組合為A1B3C2D2，即超聲溫度 45 ℃、超聲時間70 min、料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。由于正交試驗中沒有出現(xiàn)最佳工藝組合，因此在優(yōu)化后的最佳工藝組合條件下進行驗證性試驗，重復(fù)5次，得到刺槐花總黃酮平均提取率為28.69%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值為0.72%，大于正交試驗中最高提取率28.15%。結(jié)果表明，優(yōu)化后的提取工藝重復(fù)性良好，試驗數(shù)據(jù)可靠。因此，本試驗優(yōu)化后得到的提取工藝可用于刺槐花中總黃酮的提取。

2.6刺槐花總黃酮清除DPPH·的能力評價

DPPH是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，其乙醇溶液在波長517 nm處有強吸收峰，當(dāng)待測溶液中含有抗氧化物時，抗氧化物能使DPPH的特征紫色變淺或消失，且DPPH特征紫色褪色程度與抗氧化劑的抗氧化能力呈正相關(guān)[18]。因此，可根據(jù)DPPH溶液褪色程度來評價其抗氧化劑的抗氧化能力。從圖2-a可以看出，隨刺槐花總黃酮質(zhì)量濃度的增大，清除DPPH·的能力逐步增強，即清除率與刺槐花總黃酮質(zhì)量濃度間有量效關(guān)系。在所試質(zhì)量0.03～0.47 mg/mL范圍內(nèi)，當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.47 mg/mL時，DPPH·的清除率達到最大（88.04%）。雖然刺槐花總黃酮清除DPPH·的能力稍弱于維生素C清除DPPH·的能力，但刺槐花總黃酮仍然表現(xiàn)出較強的清除DPPH·的能力，表明所提取的刺槐花總黃酮具有較好的抗氧化能力。

[FK（W15][HT6H][JZ]表2對刺槐花總黃酮提取率的影響因素正交試驗結(jié)果[HTSS][STBZ]

[HJ*5][BG（！][BHDFG3，WK3，WK4。3，WK5*2，WK8*2W]試驗序號A：超聲溫度B：超聲時間C：料液比D：乙醇體積分?jǐn)?shù)總黃酮提取率（%）2.7刺槐花總黃酮清除·OH的能力評價

H2O2與FeSO4反應(yīng)會產(chǎn)生·OH，·OH具有較強的氧化能力，通過攻擊水楊酸分子中的苯環(huán)使其發(fā)生氧化反應(yīng)，生成的有色物質(zhì)在波長510 nm處的吸光度與·OH的生成量成正比[19]。若反應(yīng)體系中加入抗氧化劑，·OH受到抑制，使有色物質(zhì)生成量減少，可用清除·OH的能力來評價抗氧化物的抗氧化性。從圖2-b可以看出，刺槐花總黃酮對由H2O2/[FL）]

[FK（W12][TPZLZ2.tif][FK）]

[FL（2K2]

Fe2+體系通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH具有清除作用，且隨刺槐花總黃酮質(zhì)量濃度的增大，其清除·OH的能力逐步增強，即清除率與總黃酮的濃度間有量效關(guān)系。在所試質(zhì)量濃度0.03～0.47 mg/mL范圍內(nèi)，當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為 0.47 mg/mL 時，·OH的清除率達到最大，為34.41%。雖然刺槐花總黃酮清除·OH的能力遠遠弱于維生素C清除 ·OH 的能力，但刺槐花總黃酮也表現(xiàn)出一定的清除·OH的能力。

2.8刺槐花總黃酮清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力評價

O-2[KG-*2]· [KG-*3]可通過鄰苯三酚在弱堿介質(zhì)中自氧化產(chǎn)生，并生成有色中間產(chǎn)物，總黃酮能夠抑制 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的形成，通過在波長 325 nm 處測定有色中間產(chǎn)物的生成量，可測定總黃酮的清除能力。總黃酮能夠與 O-2[KG-*2]· [KG-*3]結(jié)合形成穩(wěn)態(tài)自由基，終止自由基鏈反應(yīng)，而發(fā)揮抗氧化作用[20]。從圖2-c可以看出，刺槐花總黃酮在所試質(zhì)量濃度0.03～0.47 mg/mL范圍內(nèi)，隨質(zhì)量濃度的增大，清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力增強，當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為047 mg/mL時， O-2[KG-*2]· [KG-*3]的清除率達到最大，為59.07%。與同質(zhì)量濃度維生素C相比，刺槐花總黃酮清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力弱于維生素C清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力，但刺槐花總黃酮依然表現(xiàn)出較強的清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力。

3結(jié)論與討論

超聲波輔助提取刺槐花總黃酮中，影響總黃酮提取效果的因素主次為超聲溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>超聲時間。經(jīng)過正交試驗優(yōu)化后得到的最佳提取工藝參數(shù)為：超聲溫度45 ℃，超聲時間70 min，料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。在該條件下進行驗證性試驗，重復(fù)5次，得到刺槐花總黃酮平均提取率為28.69%，RSD值為 0.72%。該優(yōu)化后的提取工藝具有提取率高、重復(fù)性好等優(yōu)點，可用于刺槐花總黃酮的提取。endprint

抗氧化性試驗結(jié)果表明，刺槐花總黃酮質(zhì)量濃度在 0.03～0.47 mg/mL范圍內(nèi)，隨著刺槐花總黃酮質(zhì)量濃度的增大，清除DPPH·、·OH、 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力逐步增強，且刺槐花總黃酮質(zhì)量濃度與清除率呈量效關(guān)系。當(dāng)刺槐花總黃酮質(zhì)量濃度為0.47 mg/mL時，對DPPH·、·OH、 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的清除率分別為88.04%、34.41%、59.07%。雖然與同質(zhì)量濃度的維生素C相比，清除DPPH·、·OH、 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力弱于維生素C，但刺槐花總黃酮仍然表現(xiàn)出較強的清除DPPH·、·OH、 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的能力，說明刺槐花總黃酮具有較強的抗氧化活性。

本研究結(jié)果表明，超聲輔助提取刺槐花總黃酮具有提取率高、重復(fù)性好等優(yōu)點，是一種較為理想的提取方法。超聲輔助提取得到的刺槐花總黃酮具有較強的抗氧化性，相關(guān)試驗結(jié)果為刺槐花總黃酮的提取和抗氧化的研究提供了科學(xué)依據(jù)和參考。但本試驗僅對超聲波輔助提取的刺槐花總黃酮進行體外抗氧化活性研究，而對體內(nèi)抗氧化性未進行相關(guān)研究，今后要在本試驗的基礎(chǔ)上，對超聲輔助提取的刺槐花總黃酮進行體內(nèi)抗氧性研究，為開發(fā)安全無毒的天然抗氧化劑提供科學(xué)的依據(jù)和參考。

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