楊麗君+崔紅

[摘要] 目的 探討大鼠缺血低氧腦損傷對(duì)于神經(jīng)元和髓鞘的影響情況。 方法 將3日齡SD新生大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和缺血低氧處理組，對(duì)照組不予任何特殊處理，缺血低氧處理組大鼠行左頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后休息1～2 h入封閉容器，充以8%O2+92%N2的混合氣體，處理時(shí)間為120 min，之后恢復(fù)正常氧供。待造模完成后3 d時(shí)進(jìn)行尼氏小體染色探討兩組大鼠神經(jīng)元的情況，造模后7 d進(jìn)行勞克堅(jiān)牢藍(lán)染色探討兩組大鼠的髓鞘情況。 結(jié)果 尼氏染色結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，缺血低氧處理之后大鼠腦組織中的神經(jīng)元尼氏小體染色密度明顯降低；勞克堅(jiān)牢藍(lán)染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，缺血低氧處理組的髓鞘明顯受損。 結(jié)論 大鼠缺血低氧性腦損傷對(duì)腦組織的神經(jīng)元和髓鞘造成了一定程度的影響，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織相關(guān)的功能損傷。

[關(guān)鍵詞] 腦損傷；缺血；低氧；神經(jīng)元；髓鞘

[中圖分類號(hào)] R741 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）25-0030-03

Effects of hypoxic-ischemic brain damage on neurons and myelin in immature neonatal rats

YANG Lijun CUI Hong

Department of Pediatrics， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of ischemia and hypoxic brain injury on neurons and myelin in rats. Methods Three-day-old SD neonatal rats were randomly divided into two groups including control group and ischemia-hypoxia treatment group. The control group wasnt given any special treatment. Rats in the ischemia and hypoxia treatment group were put into the closed container after left common carotid artery ligation operation and resting 1-2 hours， and the container was filled with 8%O2+92%N2 mixed gas， with the treatment time of 120 minutes， afterwards returning to normal oxygen supply. The neurons in the two groups were examined by Nedinite staining at 3 days after the completion of the modeling. The myelin sheathes of the two groups were explored by Luxol Fast Blue staining at 7 days after the compeletion of the modeling. Results The results of Nissl staining showed that， compared with that of the control group， the density of neonatal body staining was significantly decreased in the brain tissue of rats after ischemia and hypoxia treatment. Luxol Fast Blue staining results showed that the myelin sheath of the ischemic hypoxia treatment group was significantly impaired， compared with that of the control group. Conclusion Hypoxic-ischemic brain damage in rats has a certain effect on the neurons and myelin sheath of brain tissue， leading to brain tissue-related functional damage.

[Key words] Brain injury； Ischemia； Hypoxia； Neurons； Myelin sheath

缺氧缺血性腦損傷（hypoxia ischemia brain damage，HIBD）是圍產(chǎn)期引起早產(chǎn)兒和正常足月兒大腦損傷和長(zhǎng)期神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的最重要因素[1]，研究發(fā)現(xiàn)HIBD是導(dǎo)致新生兒死亡的重要原因，也是引起腦癱等嚴(yán)重后遺癥的重要原因[2]。有證據(jù)表明，在發(fā)達(dá)國(guó)家HIBD的發(fā)生率為1‰～8‰，不發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率甚至高達(dá)26‰[3，4]。造成HIBD的原因很多，如出生時(shí)產(chǎn)程延長(zhǎng)、胎兒臍帶繞頸等均有罹患HIBD的更高風(fēng)險(xiǎn)[5]，此外，早產(chǎn)是造成新生兒HIBD的另外一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素[6，7]。由于早產(chǎn)兒結(jié)構(gòu)的不成熟，對(duì)于缺氧缺血的損傷反應(yīng)更為劇烈，主要表現(xiàn)為腦室周圍白質(zhì)軟化（periventricular leukomalacia，PVL）[8-10]。早期研究發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒HIBD最主要的病理改變是腦白質(zhì)損傷[11]，但近年來(lái)的研究者認(rèn)為，早產(chǎn)兒HIBD從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)是一種全腦的損傷[12]，亦即缺氧缺血除了影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之外，對(duì)神經(jīng)元也造成相當(dāng)嚴(yán)重的影響。endprint

本研究采用3日齡SD大鼠為在體實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模擬建立人類的早產(chǎn)兒HIBD模型，在不同時(shí)間點(diǎn)探討缺血低氧對(duì)腦組織神經(jīng)元和髓鞘的影響，進(jìn)一步探討腦神經(jīng)受缺血低氧影響的機(jī)制，為日后進(jìn)行早產(chǎn)兒缺氧缺血腦損傷的合理、有效的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)別3日齡的SD大鼠（體重8～10 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2012-0001]。自制封閉容器，8%O2+92%N2的混合氣體由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院統(tǒng)一提供。

1.2 缺血低氧模型的建立

將SPF級(jí)3日齡的SD大鼠（共20只）隨機(jī)分為對(duì)照組和缺血低氧處理組，對(duì)照組不予任何處理，缺血低氧處理組首先進(jìn)行缺血模型的建立，4%水合氯醛按照10 μL/10 g的量對(duì)大鼠乳鼠進(jìn)行麻醉，固定在手術(shù)木板上之后，取左鎖骨上位置進(jìn)行開口，開口0.8～1 cm左右，小心探查，尋找左頸總動(dòng)脈，用玻璃分針小心分離動(dòng)脈，穿入2根6-0的手術(shù)線，分別結(jié)扎，兩個(gè)結(jié)扎點(diǎn)之間離斷動(dòng)脈，然后縫合，回母鼠身邊休息1～2 h，之后入自制封閉容器，充以8%O2+92%N2的混合氣體（37℃水?。瑫r(shí)間為120 min，之后回母鼠身邊休息。

1.3 尼氏小體染色步驟

焦油紫（甲酚紫，cresyl violet，CV）染色液的配制方法：溶液A：取冰醋酸4.6 mL，加水至400 mL，溶液B：取2.72 g無(wú)水乙酸鈉，加水至100 mL，將328 mL 溶液 A與72 mL 溶液 B混合后調(diào)pH至4.0（用冰乙酸），上述溶液中加入0.4 g焦油紫，充分進(jìn)行混勻，靜置一周后待用。具體染色步驟如下：冰凍切片從冰箱中取出后充分晾干，入70%酒精中4 h進(jìn)行脫脂，之后入蒸餾水洗數(shù)分鐘，0.1%焦油紫醋酸水溶液染色5 min，最后入100%酒精1 min，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.4 勞克堅(jiān)牢藍(lán)（luxol fast blue，LFB）染色步驟

取對(duì)照組和HI組冰凍切片脫水至100%酒精，入LFB染液中37℃過(guò)夜（16～24 h），冷卻至室溫，在95%酒精浸泡3～5 min洗去多余染液，用蒸餾水洗3 min，之后入0.05%碳酸鋰分色10 s，再次用蒸餾水洗3 min，入70%酒精分色，最后用梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

2 結(jié)果

2.1 缺血低氧模型成功建立

課題組前期進(jìn)行了大量的缺血低氧性腦損傷相關(guān)的工作，能夠熟練建立相關(guān)的動(dòng)物模型，動(dòng)物模型的存活率幾乎可以達(dá)到100%。造模后常規(guī)行HE染色，確認(rèn)模型建立成功與否。

2.2 尼氏小體染色

使用自配的焦油紫染色液按照染色步驟進(jìn)行腦組織神經(jīng)元尼氏小體的染色，結(jié)果提示，缺血低氧3 d后，神經(jīng)元尼氏小體數(shù)量明顯減少，且與對(duì)照組相比，尼氏小體分布不均勻，顏色變淺，深淺不一，透明度也變得不一致。見封三圖4。

2.3 勞克堅(jiān)牢藍(lán)染色

LFB染色結(jié)果提示，缺血低氧發(fā)生7 d后，胼胝體區(qū)以及側(cè)腦室周邊區(qū)域的髓鞘藍(lán)染降低，與對(duì)照組染色的鮮艷藍(lán)色不同，缺血低氧處理組的染色偏紅，提示缺血低氧7 d后，脫髓鞘現(xiàn)象非常嚴(yán)重。見封三圖5。

3 討論

缺氧缺血腦損傷是臨床常見胎兒/新生兒腦損傷，主要原因在于局部或完全腦缺氧、血流量減少或暫停，有較高的死亡率和致殘率，引起HIBD原因很多，其中早產(chǎn)是造成HIBD的重要因素之一，早產(chǎn)兒HIBD表現(xiàn)較足月兒更為嚴(yán)重，隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，早產(chǎn)兒存活率也隨之上升，近年來(lái)早產(chǎn)兒的結(jié)局也有了很大的改善，但早產(chǎn)兒由于腦損傷而帶來(lái)的后遺癥仍是不可忽略的社會(huì)問(wèn)題。HIBD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前仍尚未完全闡明，有研究者認(rèn)為HIBD損傷的主要細(xì)胞為少突膠質(zhì)細(xì)胞[13-16]，認(rèn)為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞是HIBD的易損細(xì)胞，但后來(lái)一些研究發(fā)現(xiàn)[17-19]HIBD是一種全腦損傷，HIBD發(fā)生時(shí)除了累及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元也受到嚴(yán)重?fù)p傷，本研究對(duì)此進(jìn)行了探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺血低氧的刺激下，尼氏小體數(shù)量明顯降低。研究認(rèn)為[20]尼氏小體是由許多規(guī)則而成平行排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和其間的游離蛋白體以及多核蛋白體組成的聚合體，為神經(jīng)元合成蛋白質(zhì)的主要場(chǎng)所，分布于神經(jīng)元胞漿的嗜堿性顆粒。尼氏小體的功能與神經(jīng)元的功能存在密切的關(guān)系，軸突蛋白質(zhì)大多來(lái)自神經(jīng)元胞體的尼氏小體，神經(jīng)元在其興奮傳導(dǎo)過(guò)程中，需要不斷消耗某些蛋白質(zhì)物質(zhì)，尼氏小體可提供新的蛋白質(zhì)以補(bǔ)充這種消耗[21]。正常情況下，尼氏小體在神經(jīng)元中的數(shù)量和分布具有特定性，但病理情況下，神經(jīng)元變性時(shí)，尼氏小體的變化非常敏感，逐漸由正常的塊狀或顆粒狀變成粉末狀甚至消失，本研究發(fā)現(xiàn)缺血低氧3 d后，與對(duì)照組相比，神經(jīng)元尼氏小體數(shù)量明顯減低，尼氏小體分布不均勻，顏色變淺，深淺不一，透明度也變得不一致。

造模7 d時(shí)間點(diǎn)的勞克堅(jiān)牢藍(lán)染色結(jié)果顯示，缺血低氧刺激下，即損傷發(fā)生后7 d腦組織胼胝體區(qū)域（corpus callosum，cc）和側(cè)腦室（lateral ventricle，LV）周邊髓鞘藍(lán)染率仍下降明顯，提示缺血低氧導(dǎo)致的髓鞘損傷和脫髓鞘情況較嚴(yán)重。既往研究發(fā)現(xiàn)，HIBD發(fā)生時(shí)，少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞對(duì)于缺氧缺血的刺激較為敏感，在此過(guò)程中易于受到嚴(yán)重影響，繼而導(dǎo)致髓鞘受損嚴(yán)重[22-24]，本研究也證明了這一點(diǎn)。

綜上，研究發(fā)現(xiàn)在缺血低氧腦損傷發(fā)生時(shí)，尼氏小體受到嚴(yán)重的影響，髓鞘也由于缺血低氧的刺激導(dǎo)致大量脫失，因此，如何增加缺血低氧后腦組織神經(jīng)元尼氏小體的存活、維持髓鞘的數(shù)量以及進(jìn)行髓鞘再生的治療也許是未來(lái)對(duì)早產(chǎn)兒HIBD治療的另一個(gè)可能的潛在方向。

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