擬南芥表皮細(xì)胞發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控因子GL2的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

劉靜文　張翔　齊亞飛

摘要：擬南芥HD-ZIP家族轉(zhuǎn)錄因子GLABRA2（GL2）是控制植物表皮毛、根毛分化和發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子。為了深入研究GL2調(diào)控植物表皮細(xì)胞分化發(fā)育的分子機(jī)制，對(duì)GL2蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，選擇其保守性較低的C端區(qū)域（597～776 aa）作為抗原區(qū)，構(gòu)建了pET28a/GL2原核表達(dá)系統(tǒng)。通過(guò)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)獲得了融合蛋白rGL2597～776，分子量約為196 ku。利用純化得到的融合蛋白免疫家兔，獲得了抗GL2的多克隆抗體，并利用抗原親和純化了GL2多克隆抗體。GL2多克隆抗體的制備及純化為進(jìn)一步通過(guò)染色體免疫共沉淀等方法篩選和鑒定其下游作用靶基因奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：表皮毛；根毛；GL2轉(zhuǎn)錄因子；抗體制備；原核表達(dá)

中圖分類號(hào)： Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2017）16-0029-04

收稿日期：2016-04-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31470290）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（編號(hào)：2014YB036、Z109021537）。

作者簡(jiǎn)介：劉靜文（1990—），女，新疆塔城人，碩士研究生，主要從事擬南芥表皮毛分化發(fā)育調(diào)控機(jī)理研究。E-mail：ljw0993@163com。

通訊作者：安麗君，博士，副教授，主要從事植物分子遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究。E-mail：lijunan@nwsuafeducn。

植物表皮毛和根毛是由表皮細(xì)胞向外延伸形成的特殊結(jié)構(gòu)，它們不僅是研究植物細(xì)胞分化發(fā)育的優(yōu)良模式系統(tǒng)，而且在幫助植物抵御生物和非生物逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用，因而具有重要的科研價(jià)值和實(shí)用意義[1-2]。植物表皮毛和根毛的發(fā)育受機(jī)體本身遺傳因素以及激素水平、水分、光照等環(huán)境因素的共同影響[3]。GL2是最早被發(fā)現(xiàn)的控制擬南芥表皮毛和根毛分化發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，是表皮毛細(xì)胞正常發(fā)育所必需的調(diào)控因子之一[4-5]。GL2[編碼1個(gè)含有 HD-ZIP 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，其T-DNA插入功能缺失突變體 gl2-3[WTBZ][STBZ]表現(xiàn)為表皮毛嚴(yán)重發(fā)育受阻，葉片表面光滑無(wú)毛，只在葉片的邊緣有極少的單根毛和毛狀突起，而根毛數(shù)量增多，根毛長(zhǎng)度增加[4]。在葉片發(fā)育的早期，[GL2基因在整個(gè)葉片中表達(dá)，而隨著葉片的成熟，只在表皮毛細(xì)胞及其支持細(xì)胞中表達(dá)；在根中，在非根毛細(xì)胞中特異性表達(dá)，參與根毛和非根毛細(xì)胞命運(yùn)的決定[6-7]。

目前，GL2[WTB調(diào)控植物表皮細(xì)胞分化發(fā)育的上游途徑已經(jīng)比較明確，GL1-GL3/EGL3-TTG1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體能夠激活基因的表達(dá)，并且以劑量依賴的方式調(diào)控細(xì)胞發(fā)育過(guò)程[8-9]。但是對(duì)于下游的調(diào)控路徑尚不清楚，GL2作為轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞的分化發(fā)育。GL2特異性的多克隆抗體能夠廣泛應(yīng)用于檢測(cè)GL2蛋白表達(dá)量和染色體免疫共沉淀等試驗(yàn)中，在基因組范圍內(nèi)篩選受GL2調(diào)節(jié)的基因及GL2下游直接作用靶基因，為深入探討GL2參與的表皮細(xì)胞分化發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

111供試材料

擬南芥ColumbiaCol-0生態(tài)型野生型種子，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；試驗(yàn)用家兔，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)提供，選取3只健康成年家兔用于試驗(yàn)。

112載體、菌株和試劑

原核表達(dá)載體pET28a及大腸桿菌Top10和BL21（）感受態(tài)細(xì)胞，由筆者所以實(shí)驗(yàn)室保存；試驗(yàn)中所用限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4連接酶、牛小腸堿性磷酸酶、反轉(zhuǎn)錄酶等，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；弗氏完全佐劑與不完全佐劑、蛋白免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑盒及HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體IgG，購(gòu)自Bio-Rad公司；His標(biāo)簽蛋白純化柱填料Ni Sepharose 6 Fast Flow、硝酸纖維素膜（045 μm），均購(gòu)自GE Healthcare Life Science；6×His抗體，購(gòu)自Abcam公司。

12試驗(yàn)方法

121表達(dá)序列的選取及載體構(gòu)建

對(duì)基因及其推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行分析，選取基因3′端長(zhǎng)度為 865 bp 的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，作為抗體制備的目的片段。取2周齡擬南芥野生型全部地上組織，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板分別用帶有NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的3對(duì)引物（GL2F1/R1、GL2F2/R2、GL2F3/R3）對(duì)選取的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增片段與pET28a載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10[JP3]感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。PCR擴(kuò)增所用引物序列如表1所示。[JP]

122重組蛋白的表達(dá)與純化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（菌株，獲得單克隆后將其接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為10 mmol/mL，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h；然后離心收集菌體并

進(jìn)行超聲破碎，12 000 r/min離心30 min，利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)上清液及沉淀中蛋白的表達(dá)情況和存在形式，以誘導(dǎo)前的菌液為對(duì)照組。選擇表達(dá)量較高的重組蛋白進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，對(duì)比免疫信號(hào)最終確定出最優(yōu)重組蛋白作為免疫抗原進(jìn)行進(jìn)一步純化[10-11]。對(duì)確定的最優(yōu)重組蛋白進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，用Ni Sepharose 6 Fast Flow親和柱純化融合蛋白，最后以梯度濃度的牛血清白蛋白為對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過(guò)Image Lab軟件灰度分析對(duì)目的蛋白濃度進(jìn)行定量[12]。

123多克隆抗體的制備endprint

以純化獲得的rGL2597～776重組蛋白免疫家兔，抗原量為200 μg/只，初次免疫將抗原與弗氏完全佐劑按體積比1 ∶[KG-3]1混合，背部脊柱兩側(cè)進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。第一次免疫后每隔2周加強(qiáng)免疫1次，共免疫4次。加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑，抗原量為100 μg/只。最后一次免疫 7 d 后抽取家兔心頭血約40 mL，將血液于37 ℃放置1 h后取出再置于4 ℃過(guò)夜。收集析出的血清，1 000 r/min離心 10 min 收集上清液即為免疫獲得的抗血清[13-14]。

124多克隆抗體的特異性檢測(cè)

將作為抗原的重組蛋白按1 ∶[KG-3]10 000、1 ∶[KG-3]1 000、1 ∶[KG-3]100稀釋后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將免疫獲得的血清按1 ∶[KG-3]1 000的比例作為一抗加入進(jìn)行免疫印跡雜交，通過(guò)化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)檢測(cè)目標(biāo)位置的雜交信號(hào)，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱計(jì)算抗體效價(jià)[15]。

125GL2多克隆抗體的純化

為了獲得純化的Anti-GL2抗體，降低免疫印跡試驗(yàn)中背景噪點(diǎn)的影響，利用抗原-抗體的特異性對(duì)得到的抗血清進(jìn)行純化。取約1 mg的抗原進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜使其結(jié)合于硝酸纖維素膜上；將抗原結(jié)合區(qū)域的膜經(jīng)100 mmol/mL酸性甘氨酸/鹽酸溶液（pH值為25）洗脫后封閉處理1 h；將處理后的膜裝入含有一抗（GL2抗血清）的離心管中，室溫孵育2～3 h后轉(zhuǎn)入4 ℃振蕩孵育過(guò)夜；洗膜后加入甘氨酸溶液，室溫孵育10 min，收集孵育體系中的甘氨酸溶液用1 mol/L Tris溶[JP3]液（pH值為80）調(diào)節(jié)pH值為70，獲得的甘氨酸溶液即為純化的 Anti-GL2抗體。[JP]

2結(jié)果與分析

21序列分析及表達(dá)序列的選取

利用擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（wwwarabidopsisorg）獲得了基因全長(zhǎng)序列及推測(cè)的蛋白質(zhì)序列。由圖1-a可知，基因cDNA全長(zhǎng)為2 681 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 331 bp，推測(cè)編碼1個(gè)含有776個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)（圖1-b）。為了使GL2抗體能有效地檢測(cè)到抗原，分別在SMART（http：//smartembl-heidelbergde）和SWISS-MODEL（http：//wwwexpasych/swissmod/SWISS-MODELhtml）上對(duì)GL2的結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，由圖1-b可知，GL2蛋白包含有1個(gè)保守的同源區(qū)和1個(gè)起始翻譯區(qū)，分別覆蓋130～192、280～510 aa區(qū)域；在GL2蛋白的N端（1～129 aa）和C端（516～776 aa）保守性較低。由圖1-c可知，GL2蛋白的C端親水程度較高，經(jīng)過(guò)折疊后暴露在外面，而其N端包埋在整個(gè)蛋白內(nèi)部的疏水區(qū)域中，所以選取GL2蛋白C端489～776 aa作為原核表達(dá)和制備抗體目的蛋白序列。

由表2可知，該蛋白序列兩端的氨基酸組成存在明顯的差異，489～669 aa區(qū)域的氨基酸殘基主要由帶正電的氨基酸構(gòu)成，而597～776 aa區(qū)域主要由帶負(fù)電的氨基酸殘基構(gòu)成，所以導(dǎo)致該目的蛋白序列兩端的電性相反，N端等電點(diǎn)為1073，C端等電點(diǎn)為490?？紤]到這些因素可能影響到后續(xù)的表達(dá)試驗(yàn)，又進(jìn)一步將此段蛋白序列分為2個(gè)片段連同之前選擇的C端序列一起進(jìn)行表達(dá)，并將這些片段分別命名為GL2489～776、GL2489～669、GL2597～776。

22表達(dá)序列的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pET28a/GL2的構(gòu)建

提取2周齡[WTBX][STBX]Col-0[WTBZ][STBZ]背景野生型擬南芥全部地上組織的總RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，分別以GL2489～776、GL2489～669、GL2597～776的特異引物GL2F1/R1、GL2F2/R2、GL2F3/R3進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果（圖2）表明，分別得到長(zhǎng)度為864、543、537 bp的表達(dá)片段。將PCR擴(kuò)增獲得的DNA片段與原核表達(dá)載體pET28a同時(shí)進(jìn)行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，并進(jìn)行連接，分別構(gòu)建pET28a/GL2489～776、pET28a/GL2489～669 、pET28a/GL2597～776重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，結(jié)果（圖3）表明，3段表達(dá)序列均成功連入pET28a表達(dá)載體。[FL）]

23GL2重組蛋白的原核表達(dá)、純化及定量分析

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a/GL2489～776、pET28a/GL2489～669、pET28a/GL2597～776分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，建立重組蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)。37 ℃條件下，對(duì)重組蛋白進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)使得目的蛋白大量表達(dá)。超聲破碎菌體后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況及其存在形式，以誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌液為對(duì)照。由圖4可知，在3個(gè)表達(dá)體系中，誘導(dǎo)后菌液中均出現(xiàn)了目標(biāo)蛋白條帶，而且其大小與重組蛋白的分子量對(duì)應(yīng)，證明成功誘導(dǎo)得到重組蛋白。對(duì)比上清與沉淀的蛋白條帶可以判定3種重組蛋白主要以包涵體的形式存在

從SDS-PAGE結(jié)果可以看出，重組質(zhì)粒pET28a/GL2489～669、 pET28a/GL2597～776的表達(dá)量較高，所以選用這2個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。利用誘導(dǎo)表達(dá)獲得的重組蛋白和6×His抗體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，由圖5可知，超聲破碎后，rGL2597～776沉淀中的重組蛋白表達(dá)量高于rGL2489～669，所以最終選擇以rGL2597～776重組蛋白為抗原進(jìn)行GL2抗體的制備。

重組蛋白rGL2597～776作為免疫抗原需要進(jìn)一步進(jìn)行純化。利用Ni Sepharose 6 Fast Flow親和柱對(duì)rGL2597～776進(jìn)行親和層析純化，最終得到純度較高的重組蛋白rGL2597～776。以牛血清蛋白濃度梯度為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)獲得的重組蛋白進(jìn)行定量，通過(guò)軟件灰度分析計(jì)算，最終得到40 mL濃度為09 mg/mL的重組蛋白，重組蛋白總量為36 mg。endprint

24多克隆抗體的制備與免疫檢測(cè)

以純化后的重組蛋白rGL2597～776作為抗原對(duì)家兔進(jìn)行4次免疫獲得含有GL2多克隆抗體的抗血清，將抗原稀釋 10 000、1 000、100倍后與稀釋1 000倍的抗血清進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。由圖6可知，獲得的抗血清可以特異地與誘導(dǎo)表達(dá)后的抗原結(jié)合， 這說(shuō)明成功得到重組蛋白特異性的多克隆抗

體。利用Image Lab軟件進(jìn)行灰度分析計(jì)算，抗血清最低能夠檢測(cè)到的抗原量為86 ng。

25多克隆抗體的純化

所獲得的抗血清除了含有GL2抗體外，可能還包含其他的免疫球蛋白，為了提高GL2多克隆抗體的特異性，依據(jù)抗原-抗體特異性結(jié)合的原理對(duì)獲得的抗血清進(jìn)行純化，以減少免疫檢測(cè)試驗(yàn)中背景噪點(diǎn)的影響。首先將抗血清在硝酸纖維素膜上與含大量抗原的溶液進(jìn)行免疫結(jié)合，然后通過(guò)調(diào)節(jié)溶液成分和pH值將特異性結(jié)合的抗體洗脫下來(lái)，成功獲得純度較高的多克隆抗體（圖7

3討論

擬南芥GL2蛋白相對(duì)較大，且含有2個(gè)較大的保守結(jié)構(gòu)域同源區(qū)和起始翻譯區(qū)，所以選取部分蛋白序列作為免疫抗原以保證所制備抗體的特異性。在對(duì)GL2重組蛋白序列的選擇上充分考慮蛋白結(jié)構(gòu)特征與不同結(jié)構(gòu)域的保守性情況，在保證表達(dá)蛋白特異性的前提下選取多個(gè)表達(dá)區(qū)段同時(shí)進(jìn)行載體構(gòu)建和原核表達(dá)，避免氨基酸組成差異等因素對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比選擇了表達(dá)量高且免疫性好的重組蛋白rGL2597～776作為抗原。pET28a是常用的原核表達(dá)載體，它含有的T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)能夠強(qiáng)啟動(dòng)融合基因的表達(dá)，并且其多克隆位點(diǎn)兩端的6×His標(biāo)簽可以選擇與表達(dá)蛋白的C端和N端進(jìn)行融合。融合了的6×His標(biāo)簽一方面可以幫助重組蛋白結(jié)合鎳柱純化，另一方面借助Anti-His免疫印跡試驗(yàn)可以有效地驗(yàn)證所表達(dá)的重組蛋白的正確性。通過(guò)對(duì)抗血清中GL2多克隆抗體的親和純化，能夠有效去除其他非特異性免疫球蛋白，使得獲得的多克隆抗體在植物組織蛋白等其他成分復(fù)雜的蛋白溶液中的檢測(cè)更為特異。

利用GL2多克隆抗體可以進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀以及ChIP-seq等試驗(yàn)，在基因組水平上篩選GL2潛在的下游直接作用靶基因和互作因子，進(jìn)而探索控制植物表皮毛和根毛發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，所以，GL2多克隆抗體的制備可以為植物表皮毛和根毛發(fā)育調(diào)控體系的研究奠定基礎(chǔ)。

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