李至薈 封江彬 李峰生 陸 雪 蔡恬靜 李 爽 趙 驊 田雪蕾 周丁華 劉青杰 高 玲*

電離輻射對肺腺癌細(xì)胞A549早衰的影響*

李至薈①封江彬②李峰生③陸 雪②蔡恬靜②李 爽②趙 驊②田雪蕾②周丁華③劉青杰②高 玲②*

目的：探究不同劑量X射線對肺腺癌細(xì)胞A549早衰的影響，為輻射誘導(dǎo)細(xì)胞早衰機(jī)制的探索提供理論依據(jù)。方法：采用不同劑量X射線照射肺腺癌細(xì)胞A549，按照X射線吸收劑量情況將實驗分為對照組和照射組，對照組X射線吸收劑量為0 Gy，照射組的X射線吸收劑量分別為2 Gy、4 Gy和8 Gy。利用克隆形成率實驗檢測細(xì)胞增殖能力變化，吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)，利用溶酶體紅色熒光探針Lyso-Tracker Red檢測A549細(xì)胞的溶酶體數(shù)量變化，?-半乳糖苷酶染色檢測早衰細(xì)胞。結(jié)果：照射組吸收劑量為2 Gy、4 Gy和8 Gy的A549增殖能力降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=186.45，P＜0.05)，且部分細(xì)胞體積變大，溶酶體數(shù)量增多，細(xì)胞出現(xiàn)早衰。結(jié)論：X射線可引起A549細(xì)胞增殖能力降低，溶酶體數(shù)量增加等細(xì)胞早衰癥狀。

X射線；肺腺癌細(xì)胞；早衰

早熟衰老或早衰是指細(xì)胞在非端粒信號刺激下發(fā)生增殖能力和生理功能下降，是細(xì)胞在生長、發(fā)育的過程中，形態(tài)和功能發(fā)生變化，提前出現(xiàn)退行性改變，這種形式的衰老與端?？s短無關(guān)，也與細(xì)胞增殖代數(shù)無關(guān)，即病理性衰老。能夠誘導(dǎo)細(xì)胞早衰的刺激因素包括DNA受損、氧化應(yīng)激和一些致癌基因的表達(dá)變化等[1-5]。早熟衰老的腫瘤細(xì)胞并不立即死亡，甚至可以在較長的時間內(nèi)仍具有存活力，但卻失去了增殖與轉(zhuǎn)移的能力。按著這種特性實施的以細(xì)胞衰老為靶標(biāo)的治療，雖然在縮小腫瘤體積方面的作用不強(qiáng)，但可通過帶瘤生存的方式顯著延長腫瘤患者的生存時間。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的早衰是一個很有研究前景的新的腫瘤治療策略[6]。本研究探究不同劑量X射線對肺腺癌細(xì)胞A549早衰的影響，旨在為輻射誘導(dǎo)細(xì)胞早衰機(jī)制的探索提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

(1)Precise直線加速器(瑞典Elekta公司)。

(2)特級胎牛血清和高糖培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)。培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；D-Hank's緩沖液、甲醛溶液、姬姆薩染色液和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)均為本實驗室配制；溶酶體紅色熒光探針Lyso-Tracker Red試劑盒和?-半乳糖苷酶染色試劑盒購自上海碧云天公司；人肺腺癌細(xì)胞A549購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

(1)細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞株采用含有10%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

(2)分組。按照X射線吸收劑量情況將實驗分為對照組和照射組，對照射組的X射線吸收劑量為0 Gy，照射組的X射線吸收劑量分別為2 Gy、4 Gy和8 Gy。

1.3 X射線照射

X射線照射使用Precise直線加速器產(chǎn)生的X射線單次照射細(xì)胞，源靶距為100 cm，能量為6 MV，照射組吸收劑量分別為2 Gy、4 Gy和8 Gy，采用電離室進(jìn)行劑量校準(zhǔn)。

1.4 克隆形成率實驗

常規(guī)消化指數(shù)生長期的細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液懸成單細(xì)胞后置于10 ml離心管中，密封照射，兩組細(xì)胞分別接種后置于5 ml預(yù)溫37 ℃培養(yǎng)液的60 mm培養(yǎng)皿中，接種500個細(xì)胞。以十字方向輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻。將培養(yǎng)皿移入CO2培養(yǎng)箱，在溫度為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%和濕度為95%的環(huán)境下靜置培養(yǎng)7 d后終止培養(yǎng)。用預(yù)溫的D-Hank's緩沖液洗滌2遍后再用甲醇固定20 min，去甲醇，姬姆薩染色液染色15 min，沖洗晾干后解剖顯微鏡下計數(shù)克隆數(shù)，計算克隆形成率(colony forming efficiency，CFE)為公式1：

計算存活分?jǐn)?shù)(survival fraction，SF)為公式2：

1.5 溶酶體紅色熒光探針Lyso-Tracker Red染色實驗

取少量Lyso-Tracker Red按照1∶20000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，使最終濃度為75 nmol/LnM。

使用前37 ℃預(yù)溫育。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1 ml配制好的并37 ℃預(yù)溫育的Lyso-Tracker Red染色工作液，與細(xì)胞37 ℃共孵育60 min。去除Lyso-Tracker Red染色工作液，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，可觀察到溶酶體呈明亮紅色熒光染色。

1.6 β-半乳糖苷酶染色實驗

將在6孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，加入1 mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。吸除細(xì)胞固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3 min。吸除PBS每孔加入1 ml染色工作液，于37 ℃孵育過夜，用保鮮膜封住6孔板防止蒸發(fā)。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察拍攝。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，兩組比較采用獨立樣本，每個照射組均與對照組配對，照射組與對照組之間的比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量X射線照射對細(xì)胞增殖的影響

不同劑量X射線照射后，細(xì)胞增殖能力均受到顯著抑制，照射組中吸收劑量為2 Gy時克隆形成率是對照組的67%，吸收4 Gy時細(xì)胞增殖能力降低50%，是對照組的49%，吸收8 Gy時克隆形成率僅是對照組的25%，兩組細(xì)胞增殖能力比較，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=186.45，P＜0.05)，見表1。

表1 克隆形成率檢測不同劑量X射線對A549細(xì)胞增殖的影響(%，x-±s)

2.2 不同劑量X射線照射對細(xì)胞形態(tài)的影響

經(jīng)X射線照射后的A549細(xì)胞，利用姬姆薩染色液染色后在顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，照射組吸收劑量為2 Gy、4 Gy和8 Gy的細(xì)胞形狀均變大、變平，并且隨著劑量的增大，其形態(tài)學(xué)變化越明顯， 如圖1所示。

圖1 兩組不同劑量X射線照射后A549細(xì)胞形狀變化(姆薩染色，×100)

2.3 不同劑量X射線照射對細(xì)胞溶酶體的影響

溶酶體數(shù)量的變化是早衰的另一個特征，因此，利用溶酶體紅色熒光探針Lyso-Tracker Red檢測照射后A549細(xì)胞的溶酶體數(shù)量變化，照射后細(xì)胞內(nèi)溶酶體紅色熒光顯示，溶酶體數(shù)量增多，如圖2所示。

圖2 溶酶體紅色熒光探針檢測X射線照射A549細(xì)胞后細(xì)胞胞內(nèi)溶酶體數(shù)量的改變(Lyso-Tracker Red染色，×100)

2.4 不同劑量X射線照射對細(xì)胞衰老的影響

利用?-半乳糖苷酶染色實驗檢測兩組經(jīng)X射線照射后A549細(xì)胞中的早衰細(xì)胞比例。照射組吸收劑量分別為2 Gy、4 Gy和8 Gy；對照組為0 Gy，A549細(xì)胞中出現(xiàn)部分早衰細(xì)胞，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(如圖3所示)。

圖3 ?-半乳糖苷酶染色檢測不同劑量電離輻射照射A549細(xì)胞后早衰細(xì)胞(?-半乳糖苷酶染色，×100)

3 討論

在眾多的衰老假說中，衰老蛋白質(zhì)學(xué)說研究的較為充分。本研究表明，體內(nèi)存在著衰老基因和抗衰老基因兩類，相互作用調(diào)控細(xì)胞的衰老過程。多項研究表明，誘發(fā)細(xì)胞衰老的刺激信號主要有端粒脫帽、DNA損傷、氧化應(yīng)激、癌基因過表達(dá)以及營養(yǎng)狀況不良等[7]。

電離輻射誘導(dǎo)的早衰取得了部分進(jìn)展，有研究結(jié)果表明，電離輻射可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞和人間充質(zhì)干細(xì)胞等發(fā)生早衰[8]。Wang等[9]的研究表明，吸收劑量為8 Gy的γ射線可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)由p53/p21通路誘導(dǎo)細(xì)胞早衰。Kim等[10]發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞HepG2中，輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰不依賴于p53/p21通路，而是由p16介導(dǎo)。2013-2014年陸續(xù)有課題報道，輻射可誘發(fā)包括肺癌細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞發(fā)生早熟衰老，但其研究僅限于揭示早衰現(xiàn)象及檢測下游早衰相關(guān)分子p53和p16等，而對其更上游的與放射損傷早期反應(yīng)密切關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待更深入的研究闡述[11-15]。

本研究結(jié)果表明，不同劑量X射線可引起肺腺癌細(xì)胞A549發(fā)生不同程度的早衰，出現(xiàn)一系列早衰的癥狀，具體表現(xiàn)為細(xì)胞增殖能力顯著性降低，細(xì)胞形態(tài)變大變平，細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量增加，?-半乳糖苷酶染色為藍(lán)色陽性。對于X射線引起的肺腺癌細(xì)胞A549所發(fā)生的不同程度早衰需要開展進(jìn)一步的研究，以闡明輻射引發(fā)的早衰上游信號通道。

[1]Ferrer I.Diversity of astroglial responses across human neurodegenerative disorders and brain aging[J].Brain Pathol，2017，27(5)：645-674.

[2]Martínez-Zamudio RI，Robinson L，Roux PF，et al.SnapShot：Cellular Senescence Path-ways[J].Cell，2017，170(4)：816-816.

[3]Hatanaka F，Ocampo A，Izpisua Belmonte JC.Keeping the Rhythm while Changing the Lyrics：Circadian Biology in Aging[J].Cell，2017，170(4)：599-600.

[4]Aftab A，Shah AA.Behavioral Emergencies：Special Considerations in the Geriatric Psychiatric Patient[J].Psychiatr Clin North Am，2017，40(3)：449-462.

[5]Morton L.Sexuality in the Older Adult[J].Prim Care，2017，44(3)：429-438.

[6]Cerella C，Grandjenette C，Dicato M，et al.Roles of Apoptosis and Cellular Senescence in Cancer and Aging[J].Curr Drug Targets，2016，17(4)：405-415.

[7]Jones KR，Elmore LW，Jackson-Cook C，et al.p53-Dependent accelerated senescence induced by ionizing radiation in breast tumour cells[J].Int J Radiat Biol，2005，81(6)：445-458.

[8]Cmielova J，Havelek R，Soukup T，et al.Gamma radiation induces senescence in human adult mesenchymal stem cells from bone marrow and periodontal ligaments[J].Int J Radiat Biol，2012，88(5)：393-404.

[9]Wang D，Jang DJ.Protein kinase CK2 regulates cytoskeletal reorganization during ionizing radiation-induced senescence of human mesenchymal stem cells[J].Cancer Res，2009，69(20)：8200-8207.

[10]Kim TR，Lee HM，Lee SY，et al.SM22αinduced activation of p16INK4a/retinoblastoma pathway promotes cellular senescence caused by a subclinical dose of γ-radiation and doxorubicin in HepG2 cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，400(1)：100-105.

[11]Luo H，Yount C，Lang H，et al.Activation of p53 with Nutlin-3a radiosensitizes lung cancer cells via enhancing radiation-induced premature senescence[J].Lung Cancer，2013，81(2)：167-173.

[12]Luo H，Wang L，Schulte BA，et al.Resveratrol enhances ionizing radiation-induced premature senescence in lung cancer cells[J].Int J Oncol，2013，43(6)：1999-2006.

[13]Azad A，Bukczynska P，Jackson S，et al.Co-targeting deoxyribonucleic aciddependent protein kinase and poly (adenosine diphosphate-ribose) polymerase-1 promotes accelerated senescence of irradiated cancer cells[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2014，88(2)：385-394.

[14]Beach TA，Johnston CJ，Groves AM，et al.Radiation induced pulmonary fibrosis as a model of progressive fibrosis：Contributions of DNA damage，inflammatory response and cellular senescence genes[J].Exp Lung Res，2017，43(3)：134-149.

[15]McRobb LS，McKay MJ，Gamble JR，et al.Ionizing radiation reduces ADAM10 expression in brain microvascular endothelial cells undergoing stressinduced senescence[J].Aging(Albany NY)，2017，9(4)：1248-1268.

Effect of ionizing radiation on premature senility of human lung adenocarcinoma A549

LI Zhi-hui, FENG Jiang-bin, LI Feng-sheng, et al//
China Medical Equipment,2017,14(10):134-136.

Objective: To investigate the effect of different dosages X-ray for premature senility of lung adenocarcinoma cell line A549, and provide the theoretical basis for exploring the radiation-induced mechanism of premature senility. Methods: Different dosages X-ray were adopted to radiate lung adenocarcinoma A549 cells, and all of A549 cells were divided into control group and radiation group as the adsorbed dosage of X-ray. The adsorbed dosage of control group was 0 Gy, and the adsorbed dosages of three radiation groups were 2 Gy, 4 Gy and 8 Gy, respectively. The cloning efficiency experiment was used to detect the change of cell proliferative capacity,and giemsa staining was used to observe the change of cellular morphology, and lysosome red fluorescence probe(Lyso-Tracker Red) was used to detect the change of lysosome amount. Besides, β-galactosidase staining was used to detect cell of premature senility. Results: The proliferative capacities of A549 in all of radiation groups were decreased, and the differences of proliferative capacities between three radiation groups and control group were statistically significant (F=186.45, P＜0.05). Besides, in some cells of radiation groups, the volume of cell became larger, the amount of lysosome was increase and these cell appeared premature senility. Conclusion: X-ray can lead to some symptoms of cellular premature senility include the decrease of proliferative capacity of A549 cell and the increase of lysosome amount.

X-ray; Lung adenocarcinoma cell; Premature senility

Department of General Surgery, The Second Clinical Medical College of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China.

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.10.039

李至薈,男,(1990- ),碩士研究生，山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，研究方向：肝膽胰診療。

2017-06-29

1672-8270(2017)10-0134-03

R811.5

A

國家自然科學(xué)基金面上項目(31570852)“ STAT3調(diào)控caveolin-1介導(dǎo)的抗早衰在腫瘤輻射抗性中的作用及機(jī)制研究”

①山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 山西 太原 030001

②中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國疾病預(yù)防控制中心重點實驗室 北京 100088

③火箭軍總醫(yī)院肝膽外科 北京 100088

*通訊作者：gaolingxinxin@126.com