慢性束縛應(yīng)激抑郁癥大鼠模型的復(fù)制及逍遙散對海馬色氨酸代謝途徑的調(diào)節(jié)作用

焦海燕 嚴(yán)志祎 姜幼明 劉玥蕓 陳家旭

·論著·

慢性束縛應(yīng)激抑郁癥大鼠模型的復(fù)制及逍遙散對海馬色氨酸代謝途徑的調(diào)節(jié)作用

焦海燕 嚴(yán)志祎 姜幼明 劉玥蕓 陳家旭

目的通過慢性束縛應(yīng)激方法復(fù)制大鼠抑郁癥模型，并觀察海馬色氨酸代謝途徑的變化與逍遙散的調(diào)節(jié)作用。方法將24只雄性SD大鼠隨機分成正常組、模型組、逍遙散組與氟西汀組。采用21天慢性束縛應(yīng)激的方法復(fù)制大鼠抑郁癥模型，通過大鼠體重變化、糖水偏好實驗、新環(huán)境抑制進食實驗、曠場試驗對模型進行評價。采用ELISA法測定各組大鼠海馬色氨酸(tryptophan，Trp)與5-羥色胺(5-HT)的含量。結(jié)果模型組大鼠糖水偏好量和新環(huán)境進食時間與正常組大鼠相比有顯著差異(P<0.01)；曠場試驗的中央?yún)^(qū)進入次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時間以及總穿格次數(shù)與正常組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)。ELISA結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬5-HT含量顯著低于正常組(P<0.01)，而逍遙散組和氟西汀組海馬5-HT含量明顯高于模型組(P<0.05，P<0.01)；模型組大鼠海馬中色氨酸的含量較正常組明顯增加(P<0.01)。結(jié)論在慢性束縛應(yīng)激抑郁癥大鼠海馬中存在色氨酸代謝途徑的異常，這與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)，且逍遙散能夠通過對海馬色氨酸代謝的調(diào)節(jié)起到一定的抗抑郁作用。

抑郁癥； 色氨酸代謝途徑； 5-羥色胺； 逍遙散

抑郁癥是一種以顯著而持久的心境低落為主要特征的情感障礙類精神疾病，其典型表現(xiàn)有情緒低落、思維遲鈍、對工作失去興趣、語言動作減少、不思飲食、負(fù)罪感以及自覺無用、有自殺傾向等。抑郁癥的發(fā)病機制尚不明確，目前臨床上運用的抗抑郁藥主要是基于“單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說”研發(fā)，雖具有一定治療效應(yīng)，但存在效率低、起效慢等缺點。中醫(yī)學(xué)對抑郁癥的認(rèn)識較早，但并沒有抑郁癥之病名，古代文獻多把它歸在郁證中，屬中醫(yī)學(xué)情志病范疇。抑郁癥中醫(yī)證候要素研究表明抑郁癥的病位在肝和脾，主要病性為氣郁、氣虛[1]，肝失疏泄，脾失健運，臟腑氣機紊亂，陰陽失調(diào)等是郁證的主要病機[2]。肝郁脾虛證為抑郁癥的常見證型，而逍遙散作為疏肝健脾的名方，在對抑郁癥治療方面有較好的理論及臨床基礎(chǔ)。本實驗通過慢性束縛應(yīng)激的方法復(fù)制大鼠抑郁癥模型，通過糖水偏好實驗、新環(huán)境抑制進食實驗及曠場實驗對模型進行評價。采用ELISA法檢測大鼠海馬色氨酸與5-HT的含量，并觀察逍遙散對中樞色氨酸代謝的影響，探索抑郁癥的中樞機制，以期進一步為逍遙散抗抑郁作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠，體重(200±20)g，共24只。所有大鼠在開始進行實驗前于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物三級實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，室溫為(22±2)℃，相對濕度60%±5%，環(huán)境保持安靜，正常光照、晝夜節(jié)律。動物許可證號：SCXK(Beijing)2012-0001。

1.2藥物

逍遙散出自《太平惠民和劑局方》(北柴胡30 g、茯苓15 g、當(dāng)歸30 g、白芍30 g、白術(shù)30 g、生姜10 g、炙甘草15 g、薄荷10 g)，購自北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司，由中日友好醫(yī)院中藥制劑室按照原方配伍比例煎煮、濃縮成藥粉，1 g藥粉含生藥量3.18 g，使用時需用去離子水配制成混懸液。鹽酸氟西汀膠囊(Patheon France)規(guī)格為20 mg/粒，購自禮來蘇州制藥有限公司。

1.3主要試劑和儀器

大鼠束縛架(自制)，曠場箱(自制)，WV-CP470攝像頭(Panasonic，Japan)，ACS-2EAS型電子秤(北京市菲姆斯科技開發(fā)公司)，Etho Vision3.0分析軟件(Noldus)，Serotonin ELISA kit(Enzo)，Tryptophan ELISA kit(Abnova)，低溫高速離心機(Eppendorf)，37℃恒溫箱(BINDER)，全波長掃描酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)。

1.4模型制備

采用體重隨機數(shù)分組法對24只SD大鼠進行隨機分組，分為正常組、模型組、逍遙散組、氟西汀組，共4組，每組6只。采用21天慢性束縛應(yīng)激的方法復(fù)制大鼠抑郁癥模型，大鼠束縛架底座為長20 cm、寬10 cm、厚1 cm木質(zhì)結(jié)構(gòu)，上方束縛臺長22 cm，寬6.6 cm，束縛臺的兩側(cè)各有兩條可以調(diào)節(jié)的粘貼帶，用來束縛實驗大鼠的胸腹部。

正常組大鼠采用常規(guī)方法飼養(yǎng)，不對其進行造模，其余3組大鼠每天束縛3小時。每日于束縛前1小時對模型組大鼠灌服去離子水，逍遙散組大鼠灌服逍遙散混懸液，氟西汀組灌服氟西汀溶液，并按人體有效用藥劑量進行換算。逍遙散給藥量為每100 g大鼠體重給藥0.61 g，氟西汀給藥量為每100 g體重0.2 mg，大鼠的灌胃容積為每100 g體重1 mL。造模持續(xù)21天。通過觀察大鼠體重變化，并采用糖水偏好實驗、曠場實驗、新環(huán)境抑制進食實驗對大鼠抑郁癥模型進行評價。

1.5取材

造模結(jié)束后進行取材：首先用10%水合氯醛注射大鼠腹腔，使其處于深度麻醉狀態(tài)，冰上取腦組織并分離海馬，每只大鼠稱取100 mg海馬組織放置在1.5 mL EP管中，然后加入1000 μL已經(jīng)預(yù)冷的1×PBS溶液，勻漿后存放于-20℃冰箱，反復(fù)凍融2次后，于4℃，5000 r/min條件下離心5分鐘，分裝所得蛋白上清液存放在-80℃冰箱備用。

1.6ELISA實驗

1.6.1 5-HT含量測定 實驗前將Serotonin ELISA kit試劑盒從4℃冰箱取出，放至室溫后把所用試劑離心混勻；將500 μL濃度為500 ng/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品原液分別稀釋為125、31.25、1.95、0.49 ng/mL 4個濃度；打開96孔板，根據(jù)加樣順序分別加入緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個待測樣品三個復(fù)孔，每孔100 μL；加入5-HT抗體，用封板膜將96孔板密封，室溫下?lián)u床孵育2小時，清洗3次后通過拍打除去96孔板中殘留液體；加入顯影液和終止液后立刻在酶標(biāo)儀下進行讀數(shù)，得到各孔的OD值，然后通過標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制出5-HT蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出各個樣品蛋白含量，結(jié)果和海馬重量進行換算，得到5-HT的含量和海馬組織的質(zhì)量比，以“ng/mg”表示。

1.6.2 色氨酸含量測定 提前將Tryptophan ELISA kit試劑盒從冰箱拿出，放至室溫，并把所用試劑離心、混勻；然后將25 μL蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Standard A-F(濃度依次為0、2.5、7.5、25、75、250 μg/mL)、待測樣品和對照蛋白品分別加入96孔板的相應(yīng)孔，每個樣品3個復(fù)孔；加入50 μL色氨酸抗體，4℃孵育過夜；結(jié)束后倒掉板中液體，加入清洗液清洗3次，通過拍打除去殘留液體；加入酶標(biāo)抗體工作液，孵育30分鐘后倒掉板中液體，加入清洗液清洗；加入顯影液，室溫避光孵育30分鐘后加入終止液，混勻后立即在酶標(biāo)儀下讀數(shù)，得到各孔的OD值，然后通過標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制色氨酸蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品蛋白含量，再與海馬組織重量進行換算，得到色氨酸的含量和海馬的質(zhì)量比，以“ng/mg”表示。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1各組大鼠體重變化情況

在造模開始時，各組大鼠的體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義；造模第7天，模型組大鼠體重較正常組與氟西汀組大鼠明顯降低(P<0.01)；造模第14天和21天結(jié)果顯示，正常組、逍遙散組和氟西汀組大鼠體重顯著高于模型組(P<0.01)。見表1。

2.2糖水偏好實驗和新環(huán)境抑制進食實驗結(jié)果

糖水偏好實驗的結(jié)果顯示，模型組大鼠的糖水消耗率低于其余三組，差異顯著(P<0.01)。新環(huán)境抑制進食實驗結(jié)果表明，模型組大鼠的進食時間明顯較正常組顯著延長(P<0.01)，逍遙散組與氟西汀組大鼠進食時間與模型組大鼠無統(tǒng)計學(xué)差異。見表2。

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

2.3曠場實驗結(jié)果

中央?yún)^(qū)進入次數(shù)：造模開始前，各組大鼠中央?yún)^(qū)進入次數(shù)經(jīng)過計數(shù)無明顯差異；造模第21天，模型組大鼠中央?yún)^(qū)進入次數(shù)顯著低于其余三組(P<0.05，P<0.01)。中央?yún)^(qū)停留時間：造模開始前，各組大鼠中央?yún)^(qū)停留時間并無明顯差異；造模第21天，模型組大鼠中央?yún)^(qū)停留時間顯著高于逍遙散組、正常組和氟西汀組大鼠(P<0.05，P<0.01)?？偞└駭?shù)：造模開始前，各組大鼠總穿格數(shù)并無明顯差異；造模第21天，模型組大鼠總穿格數(shù)明顯低于正常組和逍遙散組大鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4各組大鼠海馬色氨酸與5-HT的含量

5-HT蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-0.129In(x)+0.9394，R2=0.995；色氨酸蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-0.148In(x)+1.0092，R2=0.993。

與正常組相比， 模型組大鼠海馬5-HT含量顯

表1 各組大鼠體重比較

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

著降低(P<0.01)，而逍遙散組和氟西汀組海馬5-HT含量明顯高于模型組(P<0.05，P<0.01)；與其余三組相比，模型組大鼠海馬的色氨酸蛋白含量最高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。見表4。

表3 各組大鼠曠場實驗結(jié)果

注： 與正常組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01。

表4 各組大鼠5-HT和色氨酸蛋白含量

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

3 討論

本研究通過慢性束縛應(yīng)激的造模方法復(fù)制抑郁癥大鼠模型，選用逍遙散作為干預(yù)藥物，并以西藥氟西汀為對照藥物。從大鼠體重的統(tǒng)計結(jié)果可以看出，模型組大鼠與其余三組大鼠的體重差異逐漸增加，表明束縛應(yīng)激對大鼠的體重有較大影響。糖水偏好實驗作為公認(rèn)的抑郁樣行為評價方法，通過測定大鼠對糖水的偏好程度，判斷大鼠精神狀態(tài)與抑郁程度[3]。本實驗結(jié)果模型組大鼠對糖水的偏好程度顯著低于正常組，表明了其抑郁樣行為的發(fā)生。新環(huán)境抑制進食實驗則是通過實驗動物在陌生環(huán)境中進食所需的時間來判斷動物的精神、行為改變[4]，本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠在新環(huán)境中的進食時間較正常組大鼠明顯延長，進一步反映了模型大鼠的抑郁樣改變。曠場實驗是用來評價動物處在陌生環(huán)境中時所產(chǎn)生的自主探究行為的一種實驗方法，常用于抑郁癥的模型評價[5]。本研究選取大鼠中央?yún)^(qū)進入次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時間以及總穿格次數(shù)進行了分析，當(dāng)大鼠處于焦慮或抑郁狀態(tài)時，在其活動時會主動避開空曠的中央?yún)^(qū)域，選擇在相對安全的曠場箱體四周活動，減少進入中央?yún)^(qū)的次數(shù)，而當(dāng)大鼠一旦進入開闊的中央?yún)^(qū)域時，出現(xiàn)抑郁樣改變的大鼠會對向四周移動產(chǎn)生遲疑，從而增加了中央?yún)^(qū)停留時間?？偞└翊螖?shù)則主要反映了實驗動物的運動情況，當(dāng)動物精神抑郁時自主活動的欲望及運動能力也會隨之下降。在本實驗中，與正常組相比，模型組大鼠的中央?yún)^(qū)進入次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時間及總穿格次數(shù)均有顯著差異，這表明慢性束縛應(yīng)激導(dǎo)致的模型大鼠出現(xiàn)了抑郁樣的行為改變，再根據(jù)體重變化、糖水偏好以及新環(huán)境抑制進食實驗的結(jié)果可以推斷，21天慢性束縛應(yīng)激大鼠抑郁癥模型的復(fù)制基本成功。另外，從實驗結(jié)果可以看出，逍遙散對慢性束縛應(yīng)激抑郁癥模型大鼠的體重和行為表達均有一定的調(diào)節(jié)作用。

有研究表明，抑郁癥是由腦內(nèi)去甲腎上腺素與5-HT缺乏所致[6]，中樞5-HT活性的降低可增加機體對外界應(yīng)激的敏感性，產(chǎn)生精神狀態(tài)的改變，從而引起抑郁、焦慮等。5-HT是色氨酸代謝途徑中最重要的一種中間產(chǎn)物，當(dāng)機體因應(yīng)激而引起代謝速度加快時，可導(dǎo)致色氨酸水平降低，進而使5-HT的含量隨之下降，引起精神疾患的發(fā)生[7]。從本研究的結(jié)果可以看出，模型組大鼠海馬內(nèi)色氨酸的含量升高，而5-HT的含量下降，說明應(yīng)激可能抑制了海馬內(nèi)色氨酸生成5-HT的代謝途徑；逍遙散對抑郁癥模型大鼠海馬內(nèi)色氨酸代謝及5-HT的合成均有一定調(diào)節(jié)作用，表明逍遙散能使色氨酸更多地向5-HT方向轉(zhuǎn)化，對5-HT系統(tǒng)功能紊亂有一定的恢復(fù)作用，以此發(fā)揮抗抑郁的治療作用。

綜上所述，本研究成功復(fù)制了大鼠抑郁癥模型，并通過ELISA測定了慢性束縛應(yīng)激抑郁癥大鼠海馬5-HT與色氨酸的蛋白含量，進一步論證了海馬內(nèi)色氨酸和5-HT含量的變化與抑郁癥發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。逍遙散作為治療情志疾病的經(jīng)典方劑，對海馬色氨酸代謝途徑以及5-HT的含量均有調(diào)節(jié)作用。腦內(nèi)5-HT含量減少與情緒改變以及精神疾患的發(fā)生密切相關(guān)[8]，因而對色氨酸代謝與5-HT合成的深入研究能夠進一步為抑郁癥的發(fā)病機理，以及逍遙散治療抑郁癥的臨床應(yīng)用提供更完善的科學(xué)依據(jù)。

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ModelofdepressionratswithchronicimmobilizationstressandeffectsofXiaoyaosanonthechangeoftryptophanmetabolismpathway

JIAOHaiyan，YANZhiyi，JIANGYouming，etal.InstituteofTCM,BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

Correspondingauthor：CHENJiaxu，E-mail:chenjx@bucm.edu.cn

ObjectiveTo establish the depression rat model by chronic immobilization stress method，and observe the change of tryptophan metabolism pathway in hippocampus and the regulation ofXiaoyaosan.Methods24 SD rats were randomly divided into normal group，model group，Xiaoyaosangroup and fluoxetine group，the 21 days depression rat model was made by chronic immobilization stress method，and the model was evaluated by bodyweight change，sucrose preference test，novelty suppressed feeding test and open field test. ELISA method was used to determine the contents of tryptophan and 5-HT in hippocampus.ResultsThe results of sucrose preference test and novelty suppressed feeding test showed that there was a significant difference between model group and normal group (P<0.01)，the central enterance，central residence and total cross number of rats in model group were significantly different compared with that of normal group (P<0.01，P<0.05). The ELISA results showed that the content of 5-HT in hippocampus of rats in model group was significantly lower than that of normal group (P<0.01)，the contents of 5-HT of rats inXiaoyaosangroup and fluoxetine group were significantly higher than that of model group (P<0.05，P<0.01); the content of tryptophan in model group was significantly higher than normal group (P<0.01).ConclusionThere existed abnormity in the tryptophan metabolic pathway of depression model rat by chronic immobilization stress，which was closely related to the incidence of depression，andXiaoyaosancould possess antidepressant effect by regulating the tryptophan metabolism in hippocampus.

Depression； Tryptophan metabolism pathway； 5-HT；Xiaoyaosan

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.003

2017-04-21)

(本文編輯：董歷華)

國家自然科學(xué)基金面上項目(81473597)；國家自然科學(xué)基金重點項目(81630104)；北京中醫(yī)藥大學(xué)2016年校級自主課題(2016-JYB-XS012)

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院[焦海燕(碩士研究生)、嚴(yán)志祎(博士研究生)、姜幼明、劉玥蕓、陳家旭]

焦海燕(1991- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：證候的生物學(xué)基礎(chǔ)。E-mail：2548489775@qq.com

陳家旭(1966- )，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：證候的生物學(xué)基礎(chǔ)。E-mail:chenjx@bucm.edu.cn