張治軍，周文杰，李志蕓（.廣西壯族自治區(qū)桂林食品藥品檢驗所，廣西桂林5400；.桂林醫(yī)學院藥學院，廣西桂林54004）

UPLC-MS法檢測動物類藥材中氯霉素類藥物殘留Δ

張治軍1＊，周文杰1，李志蕓2（1.廣西壯族自治區(qū)桂林食品藥品檢驗所，廣西桂林541001；2.桂林醫(yī)學院藥學院，廣西桂林541004）

目的：建立檢測動物類藥材中氯霉素類藥物殘留的方法。方法：采用超高效液相色譜-質譜法。色譜柱為SB-C18，流動相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為0.2 mL/min，柱溫為35℃，進樣量為20 μL；離子源為電噴霧離子源，干燥氣溫度為350℃，干燥氣流量為5 L/min，鞘氣溫度為250℃，鞘氣流量為11 L/min，毛細管電壓為3 500 V，負離子掃描方式，多反應檢測模式。結果：氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素檢測質量濃度線性范圍均為0.5～15 ng/mL（r分別為0.999 8、0.999 9、0.998 9）；定量限分別為0.03、0.03、0.15 μg/kg，檢測限分別為0.01、0.01、0.05 μg/kg；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜3.0%；回收率分別為84.00%～112.80%（RSD＝10.15%，n＝9）、88.24%～109.80%（RSD＝7.11%，n＝9）、88.24%～99.02%（RSD＝3.91%，n＝9）。結論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復性好，可用于動物類藥材中氯霉素類藥物殘留的檢測。

動物類藥材；氯霉素類藥物殘留；超高效液相色譜-質譜法

動物類藥材的應用在我國有著悠久歷史，在中藥材的發(fā)展史中有著重要的地位。隨著自然資源的匱乏，不少動物類藥材來源由野生變?yōu)槿斯ゐB(yǎng)殖。但在養(yǎng)殖過程中，有些不法商家為了追求不正當利益，非法過量使用抗生素、雌激素等化學藥物，從而造成相關藥物殘留，最終可能對人體造成損害。而氯霉素類藥物因具有廣譜抗菌能力，價格便宜，抑菌效果好，常被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)。這類藥物性質穩(wěn)定、不易降解，極易造成殘留。已有研究證明，長期攝入氯霉素類藥物會嚴重損傷人體造血機能，可引起粒細胞缺乏癥、再生障礙性貧血，同時對消化系統(tǒng)也具有較嚴重的毒副作用[1-3]。因此，歐盟國家、美國、我國及其他一些國家嚴禁該類藥物在食用動物上使用，我國農業(yè)部235號公告（2002年）中明確把氯霉素列為食品動物養(yǎng)殖中的禁用藥物[4]。但是對于動物類藥材，有關氯霉素類藥物殘留的檢測研究目前尚未見文獻報道。本試驗以常用動物類藥材雞內金、土鱉蟲、地龍、水蛭為例，建立了以超高效液相色譜-質譜法（UPLC-MS）同時測定其中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素殘留的方法，并對市售120批動物類藥材進行了檢測，旨在為動物類藥材中氯霉素類藥物殘留的檢測和控制提出參考。

1 材料

1.1 儀器

1290Infinity型UPLC儀和6460型三重四極桿MS儀（美國Agilent公司）；XS205DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；3-30K型高速冷凍離心機（美國Sigma公司）。

1.2 試劑

氯霉素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130555-201203，純度：99.80%）；氟甲砜霉素對照品（批號：01103，純度：99.0%）、甲砜霉素對照品（批號：01103，純度：98.5%）、D5-氯霉素對照品（批號：10307AC，純度：99.0%）均購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

地龍、水蛭、雞內金、土鱉蟲藥材各30批，均購于廣西不同地區(qū)藥店和藥材市場，經廣西桂林食品藥品檢驗所饒偉文主任藥師鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件色譜柱：SB-C1（850 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～3 min，25%→70%A；3～5 min，70%→95%A；5～8 min，95%→25%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：20 μL。

2.1.2 質譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量：5 L/min；鞘氣溫度：250℃；鞘氣流量：11 L/min；毛細管電壓：3 500 V；負離子掃描方式，多反應檢測模式。質譜分析參數(shù)見表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液精密稱取待測成分對照品各10.0 mg，置于20 mL量瓶中，加D5-氯霉素內標溶液（10 ng/mL）0.10 mL，加乙腈溶解并定容，搖勻，制成氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素質量濃度均為500 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取藥材樣品2.0 g，置于50 mL離心管中，加D5-氯霉素內標溶液（10 ng/mL）0.10 mL，加堿化乙酸乙酯溶液（乙酸乙酯-25%氨水，97∶3，V/V，下同）25 mL，渦旋后水平振蕩5 min，以半徑12 cm、5 000 r/min離心10 min，取上清液，于45水浴氮氣吹干；殘渣加堿化乙酸乙酯溶液25 mL，渦旋后水平振蕩5 min，以半徑12 cm、5 000 r/min離心10 min，取上清液；合并上述上清液，于45℃水浴氮氣吹干，殘渣加4%氯化鈉溶液5 mL溶解，加正己烷萃取2次，每次5 mL，棄去正己烷，再加乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯萃取液，于45℃水浴氮氣吹干，殘渣加1 mL水溶解，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

表1 質譜分析參數(shù)Tab 1 Mass spectrometry analysis conditions

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結果，氯霉素、氟甲砜霉素與甲砜霉素色譜峰可達到很好的分離，℃且無雜質峰干擾。

圖1 提取離子流圖Fig 1 Extraction particle flow graph

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，加乙腈制成氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素質量濃度均為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 ng/mL的系列混合對照品溶液（均含D5-氯霉素內標溶液10 ng/mL）。精密量取上述系列混合對照品溶液各20 μL，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。以氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素質量濃度（x，ng/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素回歸方程分別為y＝1.909 674x－0.000 299 161（r＝0.999 8）、y＝3.926 487x+0.007 515（r＝0.999 9）、y＝0.658 704x+0.004 180（r＝0.998 9）。結果表明，氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素檢測質量濃度線性范圍均為0.5～15 ng/mL。

2.5 定量限與檢測限考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項下試驗條件進樣測定，當信噪比為10∶1時，得定量限；當信噪比為3∶1時，得檢測限。結果，氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素定量限分別為0.03、0.03、0.15 μg/kg，檢測限分別為0.01、0.01、0.05 μg/kg。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素峰面積的RSD分別為1.4%、1.5%、2.6%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下土鱉蟲藥材供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、8、12、24 h時按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果，氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素峰面積的RSD分別為1.6%、1.3%、1.5%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批土鱉蟲藥材樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果，氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素峰面積的RSD分別為2.4%、1.8%、2.2%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 回收率試驗

分別取低、中、高質量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.10 藥材樣品中氯霉素類藥物殘留量檢測

取120批藥材樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表3（表中僅列檢出氯霉素類藥物殘留的藥材樣品）。

由表3可知，檢出氯霉素類藥物殘留的雞內金藥材有18批（檢出率為60%）、地龍藥材7批（檢出率為23%）、土鱉蟲藥材4批（檢出率為13%）、水蛭藥材4批（檢出率為13%）。

3 討論

由于動物養(yǎng)殖者一味地追求經濟利益，氯霉素類藥物有意無意濫用現(xiàn)象在當前養(yǎng)殖業(yè)中普遍存在。同時，環(huán)境水質、土壤的污染也是造成該類藥物殘留的一個重要原因[5-8]。這兩種原因極易導致動物類藥材中該類藥物殘留，甚至在含動物類藥材較多的制劑中也會有氯霉素類藥物殘留[9]。從本試驗收集的藥材樣品檢測結果可知，動物類藥材中存在氯霉素類藥物殘留的現(xiàn)象比較普遍，其中雞內金藥材的殘留情況最嚴重。因此，建議有關監(jiān)管部門給予足夠重視。

表2 回收率試驗結果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

表3 藥材樣品中氯霉素類藥物殘留量檢測結果（n＝3，μg/kg）Tab 3 Results of chloramphenicol residue in medicinal herbs samples（n＝3，μg/kg）

續(xù)表3Continued Tab 3

氯霉素類藥物屬于弱極性或弱堿性化合物，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑。相關文獻[10-15]報道的提取方法多采用乙腈或乙酸乙酯提取，并經固相萃取或正己烷液液萃取去除雜質。本試驗曾比較了幾種方法的提取效果，但結果要么基質效應很大，要么需要通過固相萃取柱凈化，操作煩瑣。經過進一步試驗發(fā)現(xiàn)，采用乙酸乙酯加氨水提取藥材樣品，正己烷脫脂，乙酸乙酯萃取，操作簡便，同時可消除藥材樣品的大部分基質效應，能得到較好的回收率和檢測限。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復性好，可用于動物類藥材中氯霉素類藥物殘留的檢測。

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Determination of Chloramphenicol Residue in Animal Medicinal Herbs by UPLC-MS

ZHANG Zhijun1，ZHOU Wenjie1，LI Zhiyun2（1.Guangxi Guilin Institute for Food and Drug Control，Guangxi Guilin 541001，China；2.College of Pharmacy，Guilin Medical University，Guangxi Guilin 541004，China）

OBJECTIVE：To establish the method for determination of chloramphenicol residue in animal medicinal herbs.METHODS：UPLC-MS method was adopted.The determination was performed on SB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（gradient elution）at the flow rate of 0.2 mL/min.The column temperature was 35℃，and sample size was 20 μL.The ion source was a jet stream ion focusing electrospray ion source.The temperature and flow of drying gas were 350℃and 5 L/min，and those of sheath gas were 250℃，11 L/min，and capillary voltage was 3 500 V.Negative ion scanning mode was conducted with multiple reaction monitoring（MRM）mode.RESULTS：The linear ranges of thiamphenicol，florfenicol and chloramphenicol were 0.5-15 ng/mL（r were 0.999 8，0.999 9，0.998 9，respectively）.The limits of quantitation were 0.03，0.03，0.15 μg/kg，and the limits of detection were 0.01，0.01，0.05 μg/kg.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3.0%.The recoveries were 84.00%-112.80%（RSD＝10.15%，n＝9），88.24%-109.80%（RSD＝7.11%，n＝9），88.24%-99.02%（RSD＝3.91%，n＝9）。CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and reproducible，and can be used for determination of chloramphenicol in animal medicinal herbs.

Animal medicinal herbs；Chloramphenicol residue；UPLC-MS

R927

A

1001-0408（2017）30-4271-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.25

廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局科研項目（No.桂食藥監(jiān)科評函〔2015〕20號）

＊副主任中藥師。研究方向：藥品質量檢驗、控制。E-mail：770013802@qq.com

2017-01-24

2017-04-06）

（編輯：張靜）