● 程宛鈞 張敏建 史亞磊 危槧罡 潘旭東 林 勇 潘日潤 鄧日森 曾智承

石萆湯對腎虛夾濕型弱精子癥患者精子線粒體酶及精漿鋅的影響※

● 程宛鈞*張敏建▲史亞磊 危槧罡 潘旭東 林 勇 潘日潤 鄧日森 曾智承

目的：探討石萆湯對腎虛夾濕型弱精子癥患者精子活力、精子線粒體酶活性及精漿鋅含量的影響。方法：選取符合納入標準的病例76例，隨機分為石萆湯治療組38例；天然維生素E軟膠囊+葡萄糖酸鋅片對照組38例，檢測兩組治療前后精液常規(guī)參數(shù)；精子線粒體呼吸鏈相關(guān)酶活性：琥珀酸脫氫酶(SDH)和細胞色素C氧化酶(COX)的水平；全自動精漿生化儀測定精漿鋅含量的變化；評估治療前后中醫(yī)證候評分。結(jié)果：兩組治療后各項精液參數(shù)比較，治療組優(yōu)于對照組(P<0.05)；兩組治療后精子線粒體呼吸鏈相關(guān)酶活性值均有升高，治療組優(yōu)于對照組(P<0.05)；兩組治療后精漿鋅含量升高，治療組升高幅度高于對照組(P<0.05)；兩組治療后中醫(yī)證候評分，治療組改善程度明顯優(yōu)于對照組(P<0.01)。治療16周后再隨訪12周，治療組9例夫婦受孕成功，總有效率為86.11%；對照組僅4例夫婦受孕成功，總有效率為72.22%，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論：石萆湯對改善腎虛夾濕證弱精子癥患者的精液常規(guī)中的活力參數(shù)有明顯作用，應(yīng)與其激發(fā)精子線粒體酶活性和提高精漿鋅含量以及治療腎虛夾濕證臨床癥狀有關(guān)，進而提升不育患者夫婦受孕能力，值得進一步深入研究。

石萆湯 腎虛夾濕 弱精子癥 線粒體酶活性 精漿鋅

男性不育癥是目前成年男性的常見病、多發(fā)病，占不孕不育因素的50%左右[1]，弱精子癥常是導(dǎo)致男性不育癥的主要原因，約占19%[2]，弱精子癥產(chǎn)生的原因多與感染、精漿異常、內(nèi)分泌異常、男性附屬性腺炎癥或功能下降、精索靜脈曲張等因素有關(guān)[3]，隨著研究發(fā)現(xiàn)精子線粒體活性和精漿鋅與弱精子癥關(guān)系密切[4]。我院協(xié)定處方石萆湯是治療腎虛夾濕型弱精子癥的經(jīng)驗方，臨床應(yīng)用近三十年，療效良好[5]。為進一步探討其作用機制，筆者運用石萆湯對腎虛夾濕型弱精子癥患者進行治療，并對其改善精液參數(shù)、精子線粒體酶活性及精漿鋅含量的干預(yù)作用進行觀察，取得了滿意效果?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選自2015年8月～2017年3月在福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院男科門診就診的男性不育癥中弱精子癥患者76例，按照1∶1比例隨機分為治療組(石萆湯)38例；對照組(天然維生素E軟膠囊+葡萄糖酸鋅片)38例。年齡：治療組，23～46(30.85±9.67)歲；對照組，23～48(29.63±8.97)歲。病程：治療組，最長7年，最短15個月，平均(2.83±1.27)年；對照組，最長9年，最短13個月，平均(3.19±1.76)年。經(jīng)SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間年齡、病程均無顯著差異(P>0.05)。

1.2西醫(yī)弱精子癥診斷標準參考《實用男科學(xué)》[6]標準，進行精液分析，精液量>2mL，精子計數(shù)>20×109/L，精子總數(shù)>40×109/L，伴以下活力指標有1項或1項以上異常：60min內(nèi)，前向快速運動精子(A級)、前向慢速運動精子數(shù)(B級)和非前向運動精子(C級)，即A+B<50%，或A級<25%，或A級+B級+C級<60%者。

1.3中醫(yī)證候診斷標準參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[7]并加以修改。主癥3項，分別是舌淡紅苔厚膩，脈滑或沉細；腰膝酸軟；形寒肢冷。次癥4項，分別是精液黏稠；失眠健忘；口干口苦；嗜睡。符合主癥1項，同時兼具主癥其余各項中的任1項和次癥中任2項即可診斷。

1.4納入標準(l)23～50歲育齡男性；(2)夫妻雙方同居性生活1年以上，未采取任何避孕措施女方均未曾懷孕者[1]；(3)符合中醫(yī)證候診斷標準；(4)符合西醫(yī)弱精子癥診斷標準；(5)自愿參加本研究，并簽署知情同意書。

1.5排除標準(1)具有明確遺傳性免疫缺陷性疾病，及具有藥物、食物過敏者；(2)精漿生化分析提示伴有其它附屬性腺功能不良者；(3)全身檢查有其它內(nèi)分泌疾病、代謝性疾病者；(4)3個月內(nèi)有服用影響睪丸生精功能或附屬性腺功能藥物者；(5)先天生殖系統(tǒng)發(fā)育不良或畸形；(6)生殖道感染；(7)女方是不孕癥者；(8)拒絕參與本研究者。

1.6實驗藥物

1.6.1 治療組 石萆湯(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院協(xié)定處方)，功效：化濕祛濁、益腎填精；組成：石菖蒲20g，萆薢20g，連翹15g，黃芪30g，枸杞子20g，菟絲子30g，黃精15g，五味子10g，覆盆子10g，墨旱蓮15g，女貞子15g，懷牛膝10g。由我院全成分中藥配方顆粒劑智能中藥房全封閉配制，每劑分2包，早晚飯后各1包，開水溶解沖服，連續(xù)服用16周。

1.6.2 對照組 天然維生素E軟膠囊(珠海市湯臣倍健股份有限公司出產(chǎn)，國食健字G20110005)每日1粒，飯后服；葡萄糖酸鋅咀嚼片(浙江杭康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20083979)，每次4片，每天2次，飯后服。對照組方案藥物，連續(xù)服用16周。

1.7療效指標

1.7.1 兩組患者治療前后精液參數(shù)的變化 按WHO第4版實驗室操作手冊的標準方法[8]用徐州北斗科貿(mào)公司生產(chǎn)的BD-8000G型彩色精液分析儀(CASA)進行精液密度和活力等參數(shù)的檢測。

1.7.2 精子線粒體呼吸鏈相關(guān)酶活性測定 采用王美嬌方法[9]改進，制備精子懸液-80℃保存?zhèn)溆谩２捎肅lark[10]和王新[11]等方法將前述制備好的精子懸液，分離提取精子線粒體懸液，置于冰槽備用。嚴格按照線粒體呼吸鏈復(fù)合物試劑盒說明書設(shè)定好分光光度儀(上海尤尼柯UV-2000型)，對精子線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)和細胞色素C氧化酶(COX)的活性進行檢測。精子線粒體呼吸鏈相關(guān)酶活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.7.3 精漿鋅測定 將患者精液離心沉淀分離精子后得到精漿，按照南京欣迪生物公司出品的精漿鋅定量檢測劑試盒(PAN法)，用邁瑞公司全自動精漿生化儀(BS-400型)檢測。

1.7.4 中醫(yī)證候評分的變化 觀察兩組患者治療前后的臨床癥狀變化，并參考《中醫(yī)臨床病癥診斷療效標準》并修訂后對患者的臨床癥狀進行評分，根據(jù)無、輕、中、重程度，主癥分別評0、2、4、6分，次癥分別評0、1、2、4分[12]。

1.7.5 療效判定標準及總有效率的比較 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[7]男性不育癥的療效判定標準。痊愈：患者服藥期間以及治療后3個月內(nèi)使配偶受孕；顯效：治療后精液質(zhì)量轉(zhuǎn)為正常但配偶沒有受孕；有效：精液分析中精子密度、成活率、活動力，至少有1項提高幅度>30%；無效：治療前后精液質(zhì)量無變化?？傆行?%)=(治愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法由專人采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行臨床研究資料的匯總數(shù)據(jù)分析，對于方差齊性檢驗中方差齊的計量資料采用t檢驗，方差不齊則采用秩和檢驗；等級資料采用秩和檢驗方法。計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗，用P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1兩組精液參數(shù)治療前后比較見表1。

表1 兩組精液參數(shù)治療前后比較

注：治療前比較，1)P<0.05；與對照組比較，2)P<0.05。

2.2兩組治療前后精子線粒體呼吸鏈相關(guān)酶活性和精漿鋅含量比較見表2。

表2 兩組精子線粒體呼吸鏈相關(guān)酶活性治療前后比較

注：治療前比較，1)P<0.05；與對照組比較，2)P<0.05。

2.3兩組治療前后腎虛夾濕證中醫(yī)證候評分比較見表3。

表3 兩組治療前后腎虛夾濕證中醫(yī)證候評分比較(分

注：治療前比較，1)P<0.05；與對照組比較，2)P<0.05。

2.4兩組總體療效評價服藥16周后再隨訪12周，治療組有9例夫婦受孕成功，總有效率為86.11%。對照組僅4例夫婦受孕成功，其中1例在懷孕11周左右檢查發(fā)現(xiàn)先兆流產(chǎn)，總有效率為72.22%。兩組對比，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，說明治療組療效明顯優(yōu)于對照組。見表4。

表4 兩組治療前后總體療效的比較(例，%)，

注：與對照組比較，1)P<0.05。

2.5兩組脫落情況治療組脫落2例，對照組脫落3例，兩組共有71例完成研究。兩組脫落病例均為前往外地工作，無法定期復(fù)診觀察而中斷服藥。

3 討論

男性不育癥是嚴重影響患者生活質(zhì)量和家庭和諧的一個疾病，弱精子癥是其常見的原因，而造成弱精子癥常見因素有兩類：一類為感染因素、微量元素缺乏(如鋅)以及氧化應(yīng)激的過氧化損傷(如活性氧)、內(nèi)分泌激素異常等；另一類為精子中段線粒體病變和功能發(fā)生異常等。隨著精子超微結(jié)構(gòu)和分子研究的深入，發(fā)現(xiàn)精子運動所需能量主要來自線粒體呼吸鏈的氧化磷酸化，如果氧化磷酸化功能異常，酶活性或表達量改變及mtDNA的變異等均可能導(dǎo)致線粒體能量合成障礙，降低精子活力[4]。線粒體是細胞對食物進行器，精子細胞中也存在著線粒體[13]。所以，線粒體呼吸鏈酶活性是評價精子活力的重要參數(shù)之一。近年來線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常與精子活力低下的相關(guān)性已引起關(guān)注[4]。

SDH是線粒體呼吸酶系的關(guān)鍵酶，它位于線粒體的內(nèi)膜上，在三羧酸循環(huán)中，SDH催化琥珀酸轉(zhuǎn)化為延胡索酸，脫去的H+最后生成三磷酸腺苷，為細胞提供能量[14]。因此，SDH活性能直接反映線粒體功能和細胞能量代謝狀態(tài)。COX也是呼吸酶系中的關(guān)鍵酶之一，其酶活性變化直接影響整個呼吸鏈的功能。COX是線粒體能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控部位，在能量產(chǎn)生中起主要作用[15]。

另外，國內(nèi)外很多研究證實，鋅是機體必需的微量元素，參與精子產(chǎn)生、成熟、激活、獲能及凋亡的全過程，足量的鋅能夠維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和生理通透性、延緩精子細胞膜脂質(zhì)氧化過程，從而使精子活力良好[16]。睪丸組織對鋅的依賴性較強，因此鋅對生殖系統(tǒng)的發(fā)育與功能密切相關(guān)，鋅缺乏則加重睪丸內(nèi)氧化的損傷，降低蛋白、脂質(zhì)及核酸的含量，進而易導(dǎo)致破壞正常精子線粒體結(jié)構(gòu)。睪丸內(nèi)存在適量鋅，可對抗氧自由基等多種因素誘發(fā)的睪丸生精細胞凋亡[17，18]?？寡趸饔檬蔷S生素E重要的藥理作用，維生素E能夠通過改善附屬性腺的內(nèi)環(huán)境和分泌功能，降低精子和精漿的氧化應(yīng)激損傷，從而改善精子活力。國內(nèi)有研究表明，氧自由基的增高和線粒體信號通路分子的異常在特發(fā)性少弱精子癥患者精液中均能檢測出。少精子癥側(cè)重于凋亡，弱精子癥側(cè)重于氧化損傷[19]。氧化應(yīng)激損傷常導(dǎo)致精子線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常，造成精子活力下降，該研究還表明，活性氧(ROS)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)對精子的作用是雙面的：既損害又保護，在運動參數(shù)方面尤為顯著。ROS作用于精子線粒體通路、影響其相關(guān)參數(shù)，GSH則直接對抗ROS，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系[19]。因此，補充維生素E和鋅制劑是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用來抗氧化應(yīng)激損傷來修復(fù)線粒體功能，改善精子活力的方法。

石萆湯是我院男科協(xié)定處方，臨床用于治療腎虛夾濕型弱精子癥30余年取得了良好的療效[5，20]。針對其腎精虧虛、濕阻精竅的病機，發(fā)揮益腎祛濕強精的功用。方中石菖蒲、萆薢祛濕開竅利濁；黃芪、枸杞子、菟絲子益氣健脾滋腎；黃精、五味子、覆盆子、墨旱蓮、女貞子益腎填精；少佐連翹清熱利尿解毒，取下病上治之意；懷牛膝補肝腎、引藥下行直達病所。全方共奏益腎強精化濁之功。

本研究結(jié)果顯示，石萆湯能有效地改善各項精液參數(shù)，尤其在提升精子活力方面作用顯著；同時研究表明石萆湯能夠較快地改善精子線粒體呼吸鏈相關(guān)酶活性，使SDH和COX的水平均有升高，有效地改善精子線粒體功能狀態(tài)；治療后發(fā)現(xiàn)精漿鋅含量較治療前明顯升高，說明治療方案能夠有效地改善附屬性腺的功能，提高精漿質(zhì)量；更重要的是，通過石萆湯治療能明顯改善患者的中醫(yī)腎虛夾濕證的臨床癥狀，體現(xiàn)了中醫(yī)治療的優(yōu)勢和特色。

綜上，通過研究期間觀察和隨訪，發(fā)現(xiàn)石萆湯在總有效率和受孕率均優(yōu)于對照組，說明該方案對腎虛夾濕證弱精子癥患者的精液常規(guī)中的活力參數(shù)有明顯的改善作用，應(yīng)與其激發(fā)精子線粒體酶活性和提高精漿鋅含量以及改善腎虛夾濕證臨床癥狀有關(guān)，進而提升患者夫婦受孕能力，值得進一步深入研究。

[1]中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會男科專業(yè)委員會.男性不育癥中西醫(yī)結(jié)合診療指南(試行版)[J].中國中醫(yī)結(jié)合雜志，2015，35(9)：1034-1038.

[2]CuriSM，AriagnoJI，ChenloPH，etal.Asthenozoospermia：Analysis of a large population[J].Arch Androl 2003，49(5)：343-349.

[3]張衛(wèi)星，王 瑞.導(dǎo)致少、弱精子癥的因素和治療[J].醫(yī)學(xué)新知，2008，18(1)：18-21.

[4]鄭九嘉，樓哲豐，鄭蔚虹，等.線粒體呼吸功能與精子活力、核 DNA 損傷的相關(guān)性分析[J].中國細胞生物學(xué)學(xué)報， 2012，34(1)：34-40.

[5]張敏建，張球勇，程宛鈞，等.石萆湯治療腎虛夾濕型弱精子癥 49 例臨床觀察[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，22(4)：4-6.

[6]李宏軍，黃宇烽.實用男科學(xué)[M].第2版．北京：科學(xué)出版社， 2015：577-592.

[7]鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002：361-390．

[8]世界衛(wèi)生組織.WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊[M].第4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：5.

[9]王美嬌.精子線粒體膜蛋白Prohibitin和UPS通路相關(guān)蛋合的表達及與男性不育的相關(guān)性研究[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2012.

[10]Clark JB，Nicklas WJ．The metabolism of rat brain mitochnodria： Preparation and characterization[J]．J BiolChem，1970，245：4724-4731.

[11]王 新，陳鳳玲.線粒體的功能及檢測方法[J].醫(yī)學(xué)綜述， 2011，17(1)：12-15.

[12]李曉彤，孫紅麗，張艷杰.滋腎活血湯治療月經(jīng)過少腎虛血瘀證臨床觀察[J].光明中醫(yī)，2016，31(13)：1899-1900.

[13]黃國林，秦耀琮，王權(quán)勝，等.續(xù)斷種子方對少弱精子癥模型大鼠生精作用及其超微結(jié)構(gòu)改變的研究[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2012，34(6)：727-729.

[14]薛小平，商學(xué)軍，傅 健，等.精子線粒體琥珀酸脫氫酶檢測及其意義[J].中華男科學(xué)，2003，9(8)：601-603.

[15]李曉東，史華新，程 霞.解毒化瘀方對內(nèi)毒素血癥大鼠肝線粒體COX的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2010，20(1)：35-37.

[16]周偉強，林錦春，邵丹丹，等.淫羊藿育寶湯對腎陽虧虛型不育癥患者精子頂體酶及精漿鋅水平的影響[J].湖北中醫(yī)雜志，2016，38(3)：5-8.

[17]DuanH，WangY，AviramM，etal.SAG，a novel zinc ring finger protein that protects cells from apoptosis induced by redox agent[J].General and Comparative Endocrinology，1999，113：187-196.

[18]Summers BL，HenryCM，RofeAM，etal.Dietary zinc sup-plementation during pregnancy prevents spatial and object recogni-tion memory impairments caused by early prenatal ethanol exposure[J].Behavioural Brain Research.2008，186：230-238.

[19]張衛(wèi)東.氧自由基-線粒體信號通路在少、弱精子癥發(fā)病中的機制研究[D].河南鄭州：鄭州大學(xué)，2015.

[20]程宛鈞，張敏建，史亞磊.石萆湯對腎虛夾濕型弱精子癥精子線粒體結(jié)構(gòu)的影響[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，24(增 1)：25-26.

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項目(No.81403246)；福建省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研課題資助(No.wzsy201307)；福建省衛(wèi)生廳青年科研課題資助(No.2013-2-60)

程宛鈞，男，醫(yī)學(xué)碩士。主要從事中西醫(yī)結(jié)合男科臨床與基礎(chǔ)研究。

▲通訊作者張敏建，男，主任醫(yī)師，教授。E-mail：190078137@qq.com

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院(350004)