王金蘭，譚音玲，郭麗艷

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院，山東濰坊262500)

肺鱗癌組織miR- 146a表達(dá)變化及其對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響

王金蘭，譚音玲，郭麗艷

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院，山東濰坊262500)

目的探討miR- 146a在肺鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法采用qRT- PCR法檢測(cè)70例份肺鱗癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織、20例份正常肺組織miR- 146a表達(dá)，并分析miR- 146a表達(dá)與肺鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。篩選人肺鱗癌細(xì)胞SK- MES- 1、NCI- H520、NCI- H2170、NCI- H226及正常肺組織上皮細(xì)胞(BEAS- 2B)中miR- 146a表達(dá)最低的NCI- H520細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染miR- 146a mimics或陰性對(duì)照mimics- NC，Transwell小室法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR- 146a mimics和陰性對(duì)照mimics- NC的NCI- H520細(xì)胞遷移和侵襲能力。結(jié)果肺鱗癌組織miR- 146a表達(dá)明顯低于癌旁正常組織和正常肺組織(P均<0.01)。肺鱗癌組織miR- 146a表達(dá)與腫瘤組織分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.01)。轉(zhuǎn)染miR- 146a mimics的NCI- H520細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目較轉(zhuǎn)染mimics- NC的NCI- H520細(xì)胞明顯降低(P<0.05或<0.01)。結(jié)論肺鱗癌組織miR- 146a表達(dá)降低，其表達(dá)變化與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)；miR- 146a能夠明顯抑制肺鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

肺鱗狀細(xì)胞癌；微小RNA- 146a；細(xì)胞侵襲；細(xì)胞遷移

在肺癌的常見病理類型中，肺鱗癌的發(fā)病率僅次于肺腺癌,近年來(lái)其發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)[1～3]。目前針對(duì)驅(qū)動(dòng)基因的分子靶向治療，如EGFR酪氨酸激酶抑制劑[4]、EML4- ALK融合基因抑制劑[5]等，主要用于治療肺腺癌，關(guān)于肺鱗癌靶向治療的研究較少且進(jìn)展緩慢[6]。因此，尋找肺鱗癌敏感、特異的分子靶點(diǎn)及分子生物學(xué)標(biāo)志物迫在眉睫。微小RNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為17～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，可通過(guò)與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合，降解mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，進(jìn)而參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及細(xì)胞生長(zhǎng)等病理生理過(guò)程[7，8]。據(jù)報(bào)道，miRNA雖然僅占所有基因的1%～5%，卻參與人類約1/3蛋白編碼基因的表達(dá)調(diào)控[9]。miRNA在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有癌基因或抑癌基因作用。miR- 146a是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)作用的miRNA，在機(jī)體炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病的發(fā)生中具有重要作用[10,11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR- 146a與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展亦具有一定關(guān)系。Kumaraswamy等[12]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織miR- 146a低表達(dá)與腫瘤進(jìn)展及患者預(yù)后不良有關(guān)；Hou等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR- 146a能抑制胃癌細(xì)胞的侵襲及遷移。但miR- 146a在肺鱗癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肺鱗癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響目前尚不清楚。本研究探討miR- 146a在肺鱗癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肺鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響?，F(xiàn)分析結(jié)果并報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年10月～2015年10月濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮肺鱗癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織(距癌組織邊緣≥5 cm)各70例份，均經(jīng)組織病理檢查明確診斷。標(biāo)本來(lái)源患者男48例、女22例，年齡(58±7)歲；腫瘤最大直徑：≤2 cm者24例，>2 cm者46例；組織分化程度：低分化20例，中高分化50例；臨床分期(參照2009年第7版國(guó)際抗癌聯(lián)盟肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn))：Ⅰ、Ⅱ期31例，Ⅲ期39例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移40例；有吸煙史者53例，無(wú)吸煙史者17例。所有患者術(shù)前未行任何抗腫瘤治療，亦未合并其他器官或組織惡性腫瘤。同期收集因外傷、咯血等肺良性疾病行肺葉切除的正常肺組織標(biāo)本20例份，標(biāo)本來(lái)源患者性別、年齡等一般資料與肺鱗癌患者匹配。

1.2 組織miR- 146a表達(dá)檢測(cè) 采用qRT- PCR法。取肺鱗癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織、正常肺組織標(biāo)本，采用TRIzol法提取組織總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度，OD260/OD280為1.8～2.0。按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)：miR- 146a上游引物：5′- GGGTGAGAACTGAATTCCA- 3′，下游引物：5′- CAGTGCGTGTCGTGGAGT- 3′。按PCR試劑盒說(shuō)明配置PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR- 146a相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。比較不同組織miR- 146a表達(dá)，并分析肺鱗癌組織miR- 146a表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料 人肺鱗癌細(xì)胞系(SK- MES- 1，NCI- H520，NCI- H2170，NCI- H226)、正常肺組織上皮細(xì)胞(BEAS- 2B)，美國(guó)ATCC公司。高糖DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶，美國(guó)Life公司；miR- 146a mimics及陰性對(duì)照mimics- NC，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成；TRIzol試劑、LipofectamineTM2000，美國(guó)Invitrogen公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司；miR- 146a及內(nèi)參U6引物，廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；Transwell小室，美國(guó)Corning公司；基質(zhì)膠，美國(guó)BD公司。

1.3.2 人肺鱗癌細(xì)胞篩選 采用qRT- PCR法。取人肺鱗癌細(xì)胞(SK- MES- 1、NCI- H520、NCI- H2170、NCI- H226)和正常肺組織上皮細(xì)胞(BEAS- 2B)，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，余步驟同1.2，篩選miR- 146a相對(duì)表達(dá)量最低的細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，SK- MES- 1、NCI- H520、NCI- H2170、NCI- H226及BEAS- 2B細(xì)胞miR- 146a相對(duì)表達(dá)量分別為0.57±0.08、0.21±0.06、0.44±0.09、0.37±0.10、1.03±0.02。與BEAS- 2B細(xì)胞比較，SK- MES- 1、NCI- H520、NCI- H2170、NCI- H226細(xì)胞中miR- 146a相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P均<0.01)。NCI- H520細(xì)胞miR- 146a相對(duì)表達(dá)量明顯低于SK- MES- 1、NCI- H2170、NCI- H226細(xì)胞(P均<0.01)。故選擇NCI- H520細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 上調(diào)miR- 146a表達(dá)細(xì)胞模型建立及驗(yàn)證 取NCI- H520細(xì)胞和BEAS- 2B細(xì)胞接種于含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞鋪至培養(yǎng)瓶底80%～90%時(shí)，0.25%胰酶消化、傳代。取傳5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI- H520細(xì)胞，接種于6孔板中，隨機(jī)分為miR- 146a mimics組、mimics- NC組和空白對(duì)照組，miR- 146a mimics組每孔加入100 pmol miR- 146a mimics及5 μL轉(zhuǎn)染試劑，mimics- NC組每孔加入100 pmol mimics- NC及5 μL轉(zhuǎn)染試劑，嚴(yán)格按LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染?？瞻讓?duì)照組不進(jìn)行任何處理。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用qRT- PCR法檢測(cè)miR- 146a相對(duì)表達(dá)量，步驟同1.2。結(jié)果顯示，miR- 146a mimics組、mimics- NC組和空白對(duì)照組miR- 146a相對(duì)表達(dá)量分別為5.56±0.11、0.98±0.04、1.02±0.03，miR- 146a mimics組miR- 146a相對(duì)表達(dá)量明顯高于mimics- NC組和空白對(duì)照組(P均<0.01)。說(shuō)明上調(diào)miR- 146a表達(dá)細(xì)胞模型制作成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell小室法。實(shí)驗(yàn)前用無(wú)血清的培養(yǎng)液饑餓處理轉(zhuǎn)染miR- 146a mimics、mimics- NC的NCI- H520細(xì)胞。①細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell小室膜水化預(yù)處理，于Transwell小室上室每孔加入含2×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，下室加入含10% FBS的培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，取出小室，棉簽擦凈上室內(nèi)未遷移細(xì)胞，固定、染色，顯微鏡下觀察。隨機(jī)取5個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，以此表示細(xì)胞遷移能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。②細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將Transwell小室進(jìn)行包被基質(zhì)膜處理，用基質(zhì)膠包被Transwell小室基底膜，待基質(zhì)膠凝固后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 肺鱗癌組織、癌旁正常組織、正常肺組織miR- 146a表達(dá)比較 肺鱗癌組織miR- 146a相對(duì)表達(dá)量為0.46±0.09，癌旁正常組織和正常肺組織分別為0.99±0.04、1.03±0.03。肺鱗癌組織miR- 146a相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織和正常肺組織(P均<0.01)，而癌旁正常組織與正常肺組織比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 肺鱗癌組織miR- 146a表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 肺鱗癌組織miR- 146a表達(dá)與患者 臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 轉(zhuǎn)染miR- 146a的肺鱗癌NCI- H520細(xì)胞遷移和侵襲能力變化 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR- 146a mimics、mimics- NC的NCI- H520細(xì)胞穿入Transwell小室下室的細(xì)胞數(shù)目分別為(30±8)、(81±10)個(gè)/HP，二者比較P<0.01。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR- 146a mimics、mimics- NC的NCI- H520細(xì)胞穿入Transwell小室下室的細(xì)胞數(shù)目分別為(19±5)、(43±9)個(gè)/HP，二者比較P<0.05。

3 討論

miRNA是一類長(zhǎng)度為17～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，通過(guò)與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合，降解mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。目前已證實(shí)，在人類復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中miRNA具有極其重要的作用，在眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，很多miRNA已被證實(shí)在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起癌基因或抑癌基因作用[14]。但到目前為止，關(guān)于miRNA在惡性腫瘤中的具體分子機(jī)制仍未完全明確。

miR- 146a基因定位于染色體5q33，其在自身免疫性疾病、炎癥反應(yīng)、腫瘤等病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15]。miR- 146a在不同腫瘤中作用不同，甚至相反。如miR- 146a在胃癌[16]、乳腺癌[17]、前列腺癌[18]及胰腺癌[19]等組織中表達(dá)下調(diào)，具有類似抑癌基因作用；在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，具有類似癌基因作用[20]。說(shuō)明miR- 146a在不同腫瘤中存在組織或細(xì)胞特異性，miR- 146a在不同惡性腫瘤中可能通過(guò)調(diào)控不同的通路來(lái)參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但國(guó)內(nèi)外有關(guān)肺鱗癌組織miR- 146a表達(dá)的研究相對(duì)較少。

本研究結(jié)果顯示，肺鱗癌組織中miR- 146a表達(dá)明顯低于癌旁正常組織及正常肺組織，說(shuō)明miR- 146a在肺鱗癌中可能具有類似抑癌基因作用；肺鱗癌組織中miR- 146a表達(dá)變化與腫瘤組織分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說(shuō)明miR- 146a表達(dá)變化與肺鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，有可能作為判斷肺鱗癌進(jìn)展的分子生物學(xué)標(biāo)志物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，人肺鱗癌細(xì)胞(SK- MES- 1、NCI- H520、NCI- H2170、NCI- H226)miR- 146a表達(dá)明顯低于正常肺組織上皮細(xì)胞(BEAS- 2B)，進(jìn)一步證實(shí)miR- 146a低表達(dá)與肺鱗癌的發(fā)生有關(guān)。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征。臨床研究發(fā)現(xiàn)，約90%的惡性腫瘤患者死于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。說(shuō)明腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是影響惡性腫瘤患者預(yù)后的重要因素。研究證實(shí)，miR- 146a能夠影響惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[13,16,19]。本研究選擇miR- 146a表達(dá)最低的肺鱗癌NCI- H520細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染上調(diào)細(xì)胞中miR- 146a表達(dá)，并觀察上調(diào)miR- 146a表達(dá)對(duì)肺鱗癌NCI- H520細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR- 146a表達(dá)的肺鱗癌NCI- H520細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯降低，提示miR- 146a有可能成為肺鱗癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)。目前有關(guān)miR- 146a調(diào)控肺鱗癌細(xì)胞侵襲和遷移的具體分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確，在胰腺癌中miR- 146a通過(guò)抑制EGFR和NF- κB信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞侵襲[19，22]，在胃癌中miR- 146a通過(guò)靶向WASF2抑制胃癌細(xì)胞侵襲和遷移[16，23]。但miR- 146a在肺鱗癌中調(diào)控侵襲和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制鮮見報(bào)道，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，肺鱗癌組織miR- 146a表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)變化與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)；miR- 146a能明顯抑制肺鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，這為探討其發(fā)病機(jī)制及臨床診療提供了新思路。

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