蒙藥材手掌參中總黃酮的提取工藝及抗氧化活性研究

鄔衛(wèi)東　楊來秀　武俊婷

[摘要] 目的 優(yōu)選手掌參總黃酮的最佳提取工藝，并建立其含量測定方法，同時(shí)對手掌參總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行研究。 方法 通過正交試驗(yàn)選擇手掌參總黃酮的提取工藝；采用比色法以蘆丁為對照測定手掌參中總黃酮的含量。采用羥基自由基清除法評價(jià)其抗氧化活性。 結(jié)果 最佳提取工藝為90%乙醇，料液比1∶20，回流提取2次，每次60 min；蘆丁在0.1094～0.8752 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為98.8%，RSD為1.05%。手掌參總黃酮對羥基自由基有較強(qiáng)的清除作用。 結(jié)論 優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可靠，含量測定方法簡便，準(zhǔn)確、重復(fù)性好，不同產(chǎn)地手掌參中總黃酮的含量差異較大。手掌參總黃酮具有一定的抗氧化活性。

[關(guān)鍵詞] 手掌參；總黃酮；提取工藝；含量測定；抗氧化

[中圖分類號] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（a）-0034-04

[Abstract] Objective To optimize the extraction process of total flavonoids in Gymnadenia conopsea， establish a method of its content determination and research its antioxidant activities. Methods The orthogonal experiments was used to optimize the extraction process of total flavonoids in Gymnadenia conopsea. The content of total flavonoids were determined using rutin as reference by colorimetric. The antioxidant activity was evaluated by hydroxyl free radical scavenging activity. Results The optimized extraction conditions were 90% ethanol as solvent， material -liquid ratio of 1∶20， reflux extraction 2 times， each time 60 min. Rutin showed good linear relationship in the range of 0.1094-0.8752 mg， the average recovery was 98.8%， RSD was 1.05%. The total flavonoids possessed potential scavenging activity of hydroxyl free radical. Conclusion The optimum extraction process is stable， reliable， the method of content determination is simple， accurate， reproducible. The content of total flavonoids is quite different in Gymnadenia conopsea of different areas. The total flavonoids in Gymnadenia conopsea have obvious antioxidant activities.

[Key words] Gymnadenia conopsea； Total flavonoids； Extraction process； Content determination； Antioxidant

手掌參（Gymnadenia conopsea R.Broyn.）蒙藥名為額日赫騰乃一嘎日，異名旺拉嘎，系蘭科手參屬多年生草本植物手參（Gymnadenia conopsea R.Broyn.）的干燥塊根[1]，具有生津壯陽功效。用于遺精，虧精，陽痿，腎寒，腰腿疼痛，巴木病，痛風(fēng)，游痛癥，久病體虛等癥[2]，蒙藥手掌參作為珍貴的傳統(tǒng)藥材，具有很高的臨床藥用價(jià)值[3-6]。手掌參中主要化學(xué)成分：有機(jī)酸芐酯苷類、二苯乙烯（茋）類和菲類、皂苷類以及多糖等[7-11]。目前對手掌參定性定量研究較少[12-19]，黃酮類[20-22]成分未見文獻(xiàn)報(bào)道，本文對手掌參中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，對黃酮類成分進(jìn)行了定性鑒別和定量測定，并對其抗氧化活性進(jìn)行初步研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TU-1901型可見紫外分光光度計(jì)（北京），KQ-5200E型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限責(zé)任公司，250 W，50 Hz），其他容量儀器均經(jīng)校正。

1.2 試藥

手掌參藥材（均購自呼和浩特天力大藥店，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室楊來秀教授鑒定，產(chǎn)地分別為吉林、遼寧、四川），蘆丁對照品（購自中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-20141018），BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）購自Sigma-ALdrich（Sigma公司，美國），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液 取手掌參粉末約1 g，精密稱定，加90%乙醇20 mL，回流提取2次，每次60 min，濾過，濾液濃縮后定容至25 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.1.2 對照品溶液 精密稱取蘆丁對照品適量，加少量甲醇溶解后，用90%乙醇稀釋成每毫升含蘆丁0.2188 mg的溶液，作為對照品溶液。endprint

2.2 定性鑒別

2.2.1 鹽酸-鎂粉反應(yīng) 取供試液2 mL兩份，分置兩支試管中，其中1支加入少量鎂粉，并滴加鹽酸數(shù)滴，同置于水浴上加熱1 min后，結(jié)果不加鹽酸鎂粉的溶液為淺黃色，加鹽酸鎂粉變?yōu)榧t棕色。

2.2.2 三氯化鋁反應(yīng) 取供試液各5 mL，分置兩支試管中，其中1支加入少量1%三氯化鋁溶液，結(jié)果不加三氯化鋁溶液為淺黃色，加三氯化鋁溶液顯黃綠色熒光。

2.3 測定波長的選擇

精密量取供試品溶液4 mL，置10 mL量瓶中，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加1 moL/L氫氧化鈉4 mL，用溶劑定容至刻度，搖勻，放置15 min。以不加氫氧化鈉的溶液為空白。在370～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，另精密量取對照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，同法操作。結(jié)果供試品溶液和對照品溶液的最大吸收波長均為506 nm，故選擇506 nm作為測定波長。

2.4 提取方法的選擇

分別將下述三種提取液濾過，各精密量取4 mL，按“2.3”項(xiàng)下顯色方法顯色，測定，結(jié)果分別是2.584、2.970、3.552。結(jié)果回流法總黃酮含量較高，故選擇回流提取。

2.4.1 超聲法 稱取手掌參粉末（吉林）約1 g，精密稱定，精密加入80%乙醇25 mL，超聲提取1 h。

2.4.2 浸泡后超聲法 稱取手掌參粉末（吉林）約1 g，精密稱定，精密加入80%乙醇25 mL，浸泡過夜后，超聲提取1 h。

2.4.3 回流法 稱取手掌參粉末（吉林）約1 g，精密稱定，精密加入80%乙醇25 mL，回流提取1 h。

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5.1 正交試驗(yàn)的因素與水平 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了4因素3水平的正交試驗(yàn)，各因素水平見表1。

2.5.2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果 根據(jù)表2的正交試驗(yàn)因素和水平，按L9（34） 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案，精密稱取手掌參粉末（遼寧1）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2結(jié)果可知，影響提取率的因素依次為A>B>C>D，經(jīng)過方差分析四個(gè)因素均無顯著性差異，故由直觀分析確定最佳提取工藝條件為A3B3C2D2，即乙醇濃度為90%，料液比1∶20，提取次數(shù)為2次，提取時(shí)間為60 min。并對最佳條件進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果手掌參中總黃酮的平均含量為2.372 mg/g，說明提取條件穩(wěn)定可靠。

2.6 含量測定

2.6.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取蘆丁對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置10 mL量瓶中，按“2.3”項(xiàng)下的顯色方法進(jìn)行操作，在506 nm波長處測定吸光度。以吸光度對濃度進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：y=1.0671x-0.0004，r=0.9998。

2.6.2 精密度試驗(yàn) 將顯色后的供試品溶液，于506 nm波長處連續(xù)測定6次，結(jié)果RSD為0.22%，說明儀器的精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取手掌參粉末（遼寧1）約1 g 6份，精密稱定，加90%乙醇20 mL，回流提取2次，每次60 min，過濾，濾液濃縮并定容至25 mL，精密吸取4 mL，置10 mL量瓶中，按照“2.3”項(xiàng)下顯色方法進(jìn)行操作，在506 nm波長處測定吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為2.326 mg/g，RSD為1.72%。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對顯色后的供試品溶液每隔5 min測定1次吸光度，結(jié)果表明，供試品溶液在顯色30 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD為0.49%。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的手掌參粉末（遼寧1，含量2.326 mg/g）約0.5 g 9份，精密稱定，分別精密加入蘆丁對照品溶液（0.502 mg/mL）2、2.5、3.0 mL各三份，按“2.1.1”和“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

2.6.6 樣品測定 對不同產(chǎn)地手掌參粉末按照“2.6.3”項(xiàng)下操作，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

2.7 抗氧化活性的測定

2.7.1 手掌參不同濃度總黃酮溶液的制備 精密稱取手掌參粉末適量，按正交試驗(yàn)選擇的最佳提取工藝提取，合并提取液，定容，精密吸取適量，根據(jù)各批手掌參總黃酮含量，稀釋成不同濃度的系列溶液。

2.7.2 羥基自由基清除能力的測定 分別精密吸取上述各系列溶液1.0 mL，于10 mL具塞試管中，依次精密加入2 mmoL/L FeSO4溶液3 mL，1 mmoL/L H2O2溶液3 mL，搖勻，再加入6 mmoL/L水楊酸溶液3 mL，搖勻，置37℃水浴反應(yīng)60 min，以1 mL 75%乙醇、6 mL 95%乙醇及3 mL蒸餾水作為空白，在525 nm波長處測定其吸光度Ai，同上述操作，以3 mL蒸餾水代替H2O2溶液測定本底吸光度Aj；1mL蒸餾水代替樣品溶液測定空白對照液的吸光度A0，以BHT作為陽性對照[23]，根據(jù)以下公式計(jì)算清除率。清除率=1-[（Ai-Aj）/A0]×100%。

以清除率對濃度進(jìn)行線性回歸，計(jì)算相關(guān)系數(shù)和EC50，5批手掌參藥材及BHT的測定結(jié)果見表5，以總黃酮的濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制曲線，見圖1。由表5和圖1可知，不同批號的手掌參對羥自由基清除作用明顯，總黃酮濃度在0.03036～0.3551 mg/mL范圍內(nèi)，其羥自由基的清除率為15.75%～90.31%，且隨著手掌參總黃酮濃度增大，對羥自由基清除能力也逐步增加，說明手掌參中的總黃酮具有顯著清除羥基自由基的作用。

3 討論

本試驗(yàn)優(yōu)選所得的手掌參總黃酮最佳提取工藝條件為：溶劑濃度90%，料液比1∶20，回流提取2次，每次提取60 min；并對手掌參中總黃酮含量進(jìn)行了測定，但屬于哪種類型的黃酮還有待于進(jìn)一步研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的手掌參藥材中總黃酮的含量差異較大，且其抗氧化能力與總黃酮含量成正比關(guān)系。endprint

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（收稿日期：2017-06-13 本文編輯：李亞聰）endprint