通絡(luò)玉液湯對糖尿病大鼠大動脈內(nèi)皮細胞保護作用的機制研究

胡 慶，楊麗軍，張山起，李淑貞

通絡(luò)玉液湯對糖尿病大鼠大動脈內(nèi)皮細胞保護作用的機制研究

胡 慶1，楊麗軍2，張山起3，李淑貞1

目的探討通絡(luò)玉液湯對糖尿病大鼠大動脈血管內(nèi)皮細胞保護作用的機制。方法選取SD大鼠72只隨機分為正常對照4周組、8周組；糖尿病4周組、8周組；通絡(luò)玉液湯4周組、8周組。檢測各組大鼠血清C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。結(jié)果糖尿病4周組、8周組與對照組同時間點比較IL-6、CRP明顯增高、SOD明顯降低(Plt;0.01)；通絡(luò)玉液湯4周組、8周組與糖尿病組同時間點比較，IL-6、CRP明顯減少、SOD明顯增高(Plt;0.01)。結(jié)論通絡(luò)玉液湯能明顯改善糖尿病導(dǎo)致的大動脈血管內(nèi)皮細胞損傷，其機制可能與其抑制血管內(nèi)皮細胞的慢性炎癥反應(yīng)及清除自由基有關(guān)，與用藥時間長短無關(guān)。

糖尿?。煌ńj(luò)玉液湯；腹主動脈內(nèi)皮細胞；C反應(yīng)蛋白；白細胞介素6；超氧化物歧化酶

糖尿病是引起動脈粥樣硬化的主要原因之一，據(jù)文獻報道，40歲以上人群5年以上病程的2型糖尿病病人并發(fā)血管病變達90.8%，并發(fā)血管病的發(fā)病率是非糖尿病的20倍[1]。糖尿病血管病變，即在糖尿病狀態(tài)下的血管重構(gòu)，是糖尿病心腦血管并發(fā)癥的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，其發(fā)病機制尚未完全明確，臨床治療無有效方法，本實驗探討通絡(luò)玉液湯對糖尿病大鼠大動脈血管內(nèi)皮細胞保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與分組 清潔級健康SD大鼠72只，體重170 g～190 g[購自天津軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，編號：SCXX-(軍)2009-003]。隨機分為正常對照4周組、8周組；糖尿病4周組、8周組；通絡(luò)玉液湯4周組、8周組，每組12只。

1.1.2 藥物與試劑 通絡(luò)玉液湯組方：生曬參8 g，生黃芪30 g，生山藥20 g，麥冬15 g，知母10 g，花粉10 g，葛根10 g，五味子9 g，雞內(nèi)金6 g，丹參15 g，當(dāng)歸尾15 g，地龍8 g，60 kg人臨床1日劑量。以上中藥均購自滄州同仁堂藥店。將所購中藥飲片浸泡，水煎煮30 min，過濾；再加水煎煮30 min，過濾，兩次濾液合并，并濃縮成100%液體(每毫升含原方生藥1.7 g)，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立 72只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機選取24只，其中12只作為4周對照組，另12只作為8周對照組，普通飼料喂養(yǎng)；其余48只作為造模組給予高糖高脂飼料(20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇和67.5%基礎(chǔ)飼料)分籠喂養(yǎng)4周。第5周造模組大鼠禁食12 h，給予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(購自Sigma公司)30 mg/kg(STZ，將STZ溶于0.1 mol/L，pH4.4的檸檬酸緩沖液中，終濃度為2%，在冰水中進行，現(xiàn)配現(xiàn)用，5 min內(nèi)用完)。注射72 h后采集尾尖血(禁食12 h)，檢測血糖，濃度gt;16.7 mmol/L確定為2型糖尿病模型；正常對照組僅給予等量枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.4)腹腔注射。將符合2型糖尿病標(biāo)準(zhǔn)的大鼠，分籠繼續(xù)原飼料喂養(yǎng)，自由飲水。6周后即成糖尿病血管病變模型，模型大鼠均以原飼料再繼續(xù)喂養(yǎng)4周和8周。

1.2.2 藥物干預(yù) 將血管病變模型大鼠分組后分別給予藥物干預(yù)：通絡(luò)玉液湯組灌服通絡(luò)玉液湯，劑量為17 g/(kg·d)；正常對照組和糖尿病組每日灌服相應(yīng)劑量的生理鹽水，每周根據(jù)大鼠體重以及飼料消耗來調(diào)整藥物劑量。

1.2.3 指標(biāo)檢測 禁食12 h后，給予10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，于頸總動脈取血10 mL，6 mL用于檢測血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。其余4 mL，靜置、分離血清，ELISA法檢測C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、白介素-6(interleukin 6，IL-6)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)。ELISA試劑盒購自上海建寧生物科技公司，實驗嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖、血脂指標(biāo)比較(見表1)

組別GLUTGHDL-CLDL-CTC對照4周組5.56±1.230.31±0.193.97±1.250.27±0.091.23±1.65對照8周組5.91±2.420.53±0.864.13±2.010.35±0.321.57±0.89糖尿病4周組18.57±3.191)3.33±1.211)1.11±0.361)7.03±2.154.14±2.711)糖尿病8周組21.94±5.562)2.64±0.922)0.97±0.232)6.71±2.366.36±1.872)通絡(luò)玉液湯4周組8.58±2.493)0.82±0.263)2.63±0.853)2.67±0.833)1.74±0.92通絡(luò)玉液湯8周組6.87±1.394)0.77±0.214)3.61±0.734)1.46±0.524)1.67±0.57 與對照組4周組比較,1)Plt;0.01;與對照組8周組比較,2)Plt;0.01;與糖尿病4周組比較,3)Plt;0.01;與糖尿病8周組比較,4)Plt;0.01。

2.2 各組血清CRP、IL-6和SOD比較 糖尿病4周組、8周組血清CRP、IL-6均明顯高于對照組同時間點(Plt;0.01)，SOD明顯低于對照組同時間點(Plt;0.01)；通絡(luò)玉液湯4周組、8周組血清CRP、IL-6均明顯低于糖尿病組同時間點(Plt;0.01)，SOD高于糖尿病組同時間點(Plt;0.01)。詳見表2。

組別CRP(ng/L)IL-6(ng/L)SOD(U/mL)對照4周組15.29±0.7111.25±0.6436.43±0.71對照8周組16.18±0.3510.83±0.5134.89±0.66糖尿病4周組125.93±3.871)32.62±0.431)21.35±1.491)糖尿病8周組131.47±2.412)35.17±0.252)19.87±0.942)通絡(luò)玉液湯4周組19.27±0.953)13.08±1.393)35.28±0.413)通絡(luò)玉液湯8周組17.39±1.264)14.36±0.524)32.37±0.594) 與對照組4周組比較,1)Plt;0.01;與對照組8周組比較,2)Plt;0.01;與糖尿病4周組比較,3)Plt;0.01;與糖尿病8周組比較,4)Plt;0.01。

3 討 論

既往報道發(fā)現(xiàn)，影響血管內(nèi)皮功能因素較多[2-3]，糖尿病狀態(tài)下，持續(xù)高血糖引起血管內(nèi)皮細胞功能紊亂，導(dǎo)致血管通透性增加、白細胞向內(nèi)皮細胞的黏附增多，導(dǎo)致血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能紊亂的主要作用機制包括活性氧自由基的產(chǎn)生增加、激活炎癥相關(guān)信號通路、促進一氧化氮(NO)降解、增加內(nèi)皮素1(ET-1)含量等[6-7]。通絡(luò)玉液湯改善糖尿病的代謝紊亂，恢復(fù)內(nèi)皮細胞的正常功能。

通絡(luò)玉液湯是在玉液湯和生脈散基礎(chǔ)上加減化裁來，玉液湯記載于《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，由清代著名醫(yī)家張錫純創(chuàng)立，具益氣滋陰、固腎止渴之功。現(xiàn)代廣泛應(yīng)用于糖尿病、高血壓等疾病，但對糖尿病血管病變療效較少報道。生脈散出自《醫(yī)學(xué)啟源》，是治療氣陰兩虛證的常用方，用于治療心血管病變等屬于氣陰兩虛者。針對糖尿病血管病變氣陰兩虛，瘀血阻絡(luò)病機，本實驗利用通絡(luò)玉液湯，行益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之功，達到治療糖尿病血管內(nèi)皮細胞損傷的目的。

血管內(nèi)皮細胞內(nèi)分泌功能強大，分泌多種活性物質(zhì)如促炎因子CRP、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)，抗炎因子NO、前列環(huán)素(PG)、血管細胞間黏附分子-1(VCAM-1)等[8]。正常情況下，這些因子維持在平衡狀態(tài)，當(dāng)血管內(nèi)皮受損，其內(nèi)分泌功能失調(diào)，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)增強。

本實驗高血糖導(dǎo)致炎性因子CRP、IL-6水平明顯升高，SOD減少。CRP水平升高，抑制內(nèi)皮細胞對NO及PG的釋放，刺激ET-1及ET-1免疫樣激活物釋放，促進血管內(nèi)皮增生[9]。IL-6是由平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生的一種多功能細胞因子，可刺激血小板源生長因子(PDGF)分泌，PDGF可促進成纖維細胞、血管平滑肌細胞增殖，誘導(dǎo)成纖維細胞、巨噬細胞向血管內(nèi)膜下游走、黏附損傷血管內(nèi)皮[10]，并使血管收縮，血壓升高。高血壓進一步導(dǎo)致血管緊張素Ⅱ通過與1型受體結(jié)合使還原型輔酶Ⅰ/還原型輔酶Ⅱ氧化酶活性增強，從而產(chǎn)生大量的超氧陰離子[11]，而SOD減少，超氧陰離子增多，引起血管內(nèi)皮細胞損傷加劇[12]，啟動粥樣斑塊的形成及發(fā)展，最終導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。

通絡(luò)玉液湯能明顯減輕糖尿病的血管內(nèi)皮細胞損傷，其機制可能是：①降低GLU、TC、TG、LDL-C、升高HDL-C，減少內(nèi)皮細胞膜糖基化[13]，減輕全身氧化應(yīng)激狀態(tài)和過亞硝酸鹽形成損傷動脈的彈性蛋白，減輕LDL-C被巨噬細胞吞噬形成泡沫細胞，進而減輕動脈硬化[14]；②提高SOD活性，減輕超氧陰離子對內(nèi)皮細胞的損傷[15]，增加內(nèi)皮細胞生成[16]；③減少CRP、IL-6分泌，減輕血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)[17]；④提高NO水平，NO是一種重要的內(nèi)源性抗動脈粥樣硬化介質(zhì)，具有舒張血管、抑制血小板黏附和聚集、抑制白細胞黏附和遷移、減少氧自由基和氧化型低密度脂蛋白作用，減輕內(nèi)皮細胞損傷[18]。

本實驗通過檢測通絡(luò)玉液湯治療大鼠血清CRP、IL-6、SOD變化，發(fā)現(xiàn)通絡(luò)玉液湯對糖尿病大鼠動脈血管內(nèi)皮細胞的保護作用，與減輕炎癥反應(yīng)和增強超氧化物歧化酶活性密切相關(guān)，但具體機制尚待進一步研究。

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2017-01-23)

(本文編輯 薛妮)

Protective Mechanism of Tongluo Yuye Decoction on Aortic Endothelial Cells of Diabetic Rats

Hu Qing， Yang Lijun， Zhang Shanqi， Li Shuzhen

Cangzhou Medical College， Cangzhou 061001， Hebei，China

Yang Lijun (Cangzhou Central Hospital， Cangzhou， Hebei，China)

Objective To investigate the protective mechanism of Tongluo Yuye decoction (TYD) on aortic endothelial cells of diabetic rats. Methods Seventy-two Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into three groups: control group (4-week group， group A；8-week group， group B)， diabetic group (4-week group， group C；8-week group， group D)，and TYD group (4-week group， group E；8-week group，control group F). The levels of of serum C-reactive protein (CRP)， interleukin-6 (IL-6)，and superoxide dismutase (SOD) were measured and compared. Results Compared with control group，the level of SOD was decreased while the levels of IL-6，CRP were elevated significantly in diabetic group at the same time(Plt;0.01). Compared with diabetic group，the level of SOD was increased while the levels of IL-6，CRP were decreased significantly in TYD group at the same time(Plt;0.01). Conclusion TYD can obviously improve the damage of aortic endothelial cells caused by diabetes. The mechanism may be related to the inhibition of chronic inflammatory reaction of vascular endothelial cells and the clearance of free radicals.

diabetes；Tongluo Yuye decoction；abdominal aortic endothelial cells；C-reactive protein；interleukin-6；superoxide dismutase

R587.1 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.20.008

1672-1349(2017)20-2543-03

2015年滄州市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃項目(No.151302098)

1.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校(河北滄州 061001)；2.河北省滄州市中心醫(yī)院；3.滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院

楊麗軍，E-mail：czyzhq@126.com

信息：胡慶，楊麗軍，張山起，等.通絡(luò)玉液湯對糖尿病大鼠大動脈內(nèi)皮細胞保護作用的機制研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(20)：2543-2545.