混合鹽脅迫對(duì)水飛薊種子萌發(fā)期耐鹽性及水飛薊賓含量的影響

劉廣娜+楊祥波+胡善凱

摘要：以水飛薊為試驗(yàn)材料，采用濃度為0.1、0.2、0.3 mol/L的混合鹽（NaCl、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4等物質(zhì)量混合）溶液分別對(duì)水飛薊種子進(jìn)行處理，計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)鹽害率；選擇大田中長(zhǎng)勢(shì)相近的水飛薊植株進(jìn)行不同濃度混合鹽溶液的脅迫處理，測(cè)定水飛薊素和水飛薊賓的含量。結(jié)果顯示，相對(duì)鹽害率隨著處理混合鹽溶液濃度的增大而增加，0.1 mol/L混合鹽溶液處理下，種子相對(duì)鹽害率為0；發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)在0.1 mol/L混合鹽溶液處理下最高，且高于對(duì)照組；水飛薊素和水飛薊賓的含量均隨著混合鹽溶液濃度的增高呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，以 0.2 mol/L 混合鹽溶液的促進(jìn)作用最好。

關(guān)鍵詞：混合鹽；脅迫；水飛薊；耐鹽性；相對(duì)鹽害率；水飛薊素；水飛薊賓

中圖分類號(hào)： S567.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0144-03

中藥水飛薊為菊科（Asteracea）水飛薊屬植物水飛薊[Silybum marianum （L.） Gaertn]的干燥成熟果實(shí)，是一味常用的清熱解毒、疏肝利膽的藥物[1]。其主要成分是水飛薊素，具有抗自由基活性、抗脂質(zhì)過氧化作用、抗脂氧酶等作用[2]。水飛薊素中以水飛薊賓為主，還含有異水飛薊賓和水飛薊寧[3]。

季平等研究在不同類型鹽堿脅迫下，耐鹽堿大豆品種的各器官生物量、莢數(shù)、粒數(shù)、產(chǎn)量和生長(zhǎng)性狀均顯著高于鹽堿敏感品種[4]。隨著全球工業(yè)化的發(fā)展，環(huán)境污染的加劇，二氧化碳排放量的增加，逐漸形成溫室效應(yīng)，造成全球氣溫升高，海平面不斷上升，由此引起土壤鹽漬化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重[5]。當(dāng)前全世界有 9.55 億hm2鹽堿地，我國(guó)約有2 600萬hm2鹽堿地，其中約660萬hm2鹽堿耕地。因此，開發(fā)利用鹽堿地，提高鹽堿地的利用率，具有十分重要的意義。本試驗(yàn)主要研究不同濃度混合鹽溶液對(duì)水飛薊種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)鹽害率、水飛薊素和水飛薊賓含量的影響，選出適宜濃度的混合鹽溶液，以期為探究水飛薊栽培新技術(shù)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用水飛薊種子購(gòu)自安徽亳州明雨中藥材銷售有限公司，種于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院九站藥用植物園。

1.2 萌發(fā)期耐鹽性比較

選取大小相同、飽滿的水飛薊種子，用1% NaClO溶液浸泡15 min后，無菌水反復(fù)沖洗，用0.1、0.2、0.3 mol/L混合鹽（NaCl、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4等物質(zhì)量混合）溶液分別浸泡種子4 h，再將種子均勻地置于鋪有2層濾紙、直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，各加入8 mL相應(yīng)的混合鹽處理溶液，溫度設(shè)定為25 ℃，放在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理50粒種子，重復(fù)3次，為了保證混合鹽溶液的濃度，每隔2 d換1次處理液及濾紙。每天記錄發(fā)芽種子數(shù)，以胚根突破種皮記為種子萌發(fā)，計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)鹽害率[6]。計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率=（9 d累積發(fā)芽的種子數(shù)/供檢測(cè)的種子總數(shù)）×100%；

發(fā)芽勢(shì)=（4 d累積發(fā)芽的種子數(shù)/供檢測(cè)的種子總數(shù)）×100%；

相對(duì)鹽害率=（對(duì)照發(fā)芽率-處理發(fā)芽率）/對(duì)照發(fā)芽率×100%。

當(dāng)處理發(fā)芽率大于對(duì)照發(fā)芽率時(shí)相對(duì)鹽害率記為0，視為無鹽害。

1.3 混合鹽脅迫水飛薊植株

選擇大田中長(zhǎng)勢(shì)相近、生長(zhǎng)旺盛、無病蟲害的水飛薊植株進(jìn)行混合鹽脅迫處理。試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置對(duì)照組（CK）和處理組?；旌消}處理組設(shè)0.1、0.2、0.3 mol/L等3個(gè)濃度水平，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)處理澆灌量為 300 mL，對(duì)照組澆灌等量自來水。每10 d澆灌1次，連續(xù)澆灌3次。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 水飛薊素含量的測(cè)定 稱取2 mg水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品，用80%乙醇溶液溶解并定容到10 mL容量瓶中，配成水飛薊賓對(duì)照品母液，分別吸取水飛薊賓對(duì)照品母液0、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，將母液稀釋成不同濃度，用80%乙醇溶液定容至10 mL，于紫外分光光度計(jì)上測(cè)定288 nm處的吸光度（D288 nm），根據(jù)測(cè)定的結(jié)果，以水飛薊賓對(duì)照品母液的濃度為x軸，D288 nm為y軸，得到線性相關(guān)方程為y=0.790 7x+0.000 1，r2=0.999 5，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取2 g水飛薊種子粉于提取燒瓶中，置于超聲波水箱中，每次用12 mL乙酸乙酯溶液在50 ℃下浸提4 h，共計(jì)2次，將浸提液合并，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙酸乙酯，經(jīng)過真空干燥得到黃色粉末狀提取物，稱取2 mg水飛薊提取物，然后加入80%乙醇溶液，用超聲波輔助溶解，過濾，定容至10 mL，即為提取物母液，于紫外分光光度計(jì)上測(cè)定288 nm處的吸光度（D288 nm），最后再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出提取物中水飛薊賓的含量[7]。

1.4.2 水飛薊賓含量的測(cè)定 色譜條件的選擇：色譜柱為Shimadzu C18（150 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸（體積比為48 ∶ 52 ∶ 1），流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為288 nm。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：分別精密稱取水飛薊賓A、B標(biāo)準(zhǔn)品各1 mg，各加入1 mL的色譜純甲醇溶解，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液即為高效液相法（HPLC）測(cè)定用的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別取HPLC測(cè)定用水飛薊賓A、B標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1、2、3、4、5 μL，按設(shè)定好的色譜條件進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，分別得到水飛薊賓A、B的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1、圖2所示。

供試品溶液的制備：精密稱取1 g干燥種子粉，用50 mL的石油醚在70 ℃回流3 h。等待提取完成后，將溶液過濾，殘?jiān)脼V紙包裹再用溫風(fēng)吹干。精密加入150 mL乙酸乙酯溶液，78 ℃水浴回流3 h，過濾，然后用20 mL乙酸乙酯溶液分成2次洗滌燒瓶和濾紙。將濾液和洗滌液合并在一起濃縮至干，再用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，即為高效液相測(cè)定用的供試溶液。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度混合鹽脅迫對(duì)水飛薊種子萌發(fā)期耐鹽性的影響

2.1.1 不同濃度混合鹽脅迫對(duì)種子發(fā)芽率的影響 由圖3可知， 在0.1 mol/L混合鹽溶液處理下，水飛薊種子發(fā)芽率高于對(duì)照組，對(duì)種子發(fā)芽有促進(jìn)作用。但隨著混合鹽溶液濃度的增大，發(fā)芽率逐漸降低，且低于對(duì)照組。

2.1.2 不同濃度混合鹽脅迫對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)的影響 由圖4可知，在0.1 mol/L混合鹽溶液處理下，水飛薊種子的發(fā)芽勢(shì)高于對(duì)照組，但隨著混合鹽溶液濃度的增大，發(fā)芽勢(shì)先降低后上升，但均低于對(duì)照組。

2.1.3 不同濃度混合鹽脅迫對(duì)種子相對(duì)鹽害率的影響 由圖5可知，0.1 mol/L混合鹽溶液對(duì)水飛薊種子沒有鹽害，且相對(duì)鹽害率隨著混合鹽溶液濃度的增大而升高。

2.2 不同濃度混合鹽脅迫對(duì)水飛薊素含量的影響

由圖6可知，水飛薊素的含量隨著混合鹽溶液濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)混合鹽溶液濃度為0.2 mol/L時(shí)水飛薊素的含量最高，比對(duì)照組高19%。

2.3 不同濃度混合鹽脅迫對(duì)水飛薊中水飛薊賓含量的影響

2.3.1 對(duì)照組植株中水飛薊賓含量的測(cè)定結(jié)果 由圖7可知，對(duì)照組植株提取物中含有水飛薊賓A和水飛薊賓B，通過水飛薊賓A和水飛薊賓B的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出水飛薊賓A含量為 2.518 04 μg/mL，水飛薊賓B含量為 3.586 13 μg/mL。

2.3.2 0.1 mol/L混合鹽溶液脅迫下植株中水飛薊賓含量的測(cè)定結(jié)果 由圖8可知，0.1 mol/L混合鹽溶液處理組含有水飛薊賓A和水飛薊賓B，通過水飛薊賓A和水飛薊賓B的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出水飛薊賓A含量為12.929 61 μg/mL，水飛薊賓B含量為19.239 21 μg/mL，且水飛薊賓A、B的含量均遠(yuǎn)高于對(duì)照組中的含量，說明0.1 mol/L混合鹽處理對(duì)水飛薊賓合成具有較好的促進(jìn)作用。

2.3.3 0.2 mol/L混合鹽溶液脅迫下植株中水飛薊賓含量測(cè)定結(jié)果 由圖9可知，0.2 mol/L混合鹽溶液處理組中含有水飛薊賓A和水飛薊賓B，通過水飛薊賓A和水飛薊賓B的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出水飛薊賓A含量為17.245 62 μg/mL，水飛薊賓B含量為25.627 50 μg/mL，且水飛薊賓A、B的含量均高于對(duì)照組和0.1 mol/L混合鹽溶液處理組中的含量，說明 0.2 mol/L 混合鹽處理對(duì)水飛薊賓合成具有極好的促進(jìn)作用。

由圖10可知，0.3 mol/L混合鹽溶液處理組含有水飛薊賓A和水飛薊賓B，通過水飛薊賓A和水飛薊賓B的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出水飛薊賓A含量為5.013 48 μg/mL，水飛薊賓B含量為7.472 92 μg/mL，且水飛薊賓A、B的含量均高于對(duì)照組中的含量，但低于0.1、0.2 mol/L混合鹽溶液處理組中的含量，說明 0.3 mol/L 混合鹽溶液處理對(duì)水飛薊賓合成具有促進(jìn)作用，但隨著混合鹽濃度的升高，水飛薊賓的含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。

3 討論

在本試驗(yàn)所采用的3種濃度混合鹽溶液的脅迫下，0.1 mol/L 混合鹽溶液處理下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)均明顯高于對(duì)照組，且對(duì)種子萌發(fā)的相對(duì)鹽害率為0；水飛薊素和水飛薊賓的含量均隨著混合鹽溶液處理濃度的升高呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，以0.2 mol/L混合鹽溶液的促進(jìn)效果最好。

通過本試驗(yàn)的研究，可以初步確定適量濃度的鹽堿地可以有助于水飛薊素及水飛薊賓含量的增加。期望本研究的結(jié)果可為研究鹽堿脅迫對(duì)水飛薊中有效成分含量的影響提供參考。

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