高產(chǎn)香乳酸菌菌株的選育

杜磊　楊利玲　孔雪麗

摘要：以從市售酸奶花花牛中分離出的10株保加利亞乳桿菌和10株嗜熱鏈球菌為研究對象，通過紫外誘變后，采用碘滴定法和鄰苯二胺比色法，篩選出高產(chǎn)乙醛和高產(chǎn)雙乙酰的菌株，最終確定最佳誘變參數(shù)為紫外照射波長 365 nm、垂直照射距離15cm、照射時間為120 s。篩選出的高產(chǎn)乙醛菌株為L-22、L-2a、L-2D 菌株，產(chǎn)乙醛量分別為1351、1652 、1446 μgmL，相比出發(fā)菌株（1265 μgmL）分別增加了68%、306%、143%。篩選出的高產(chǎn)雙乙酰菌株為S-14、S-1d菌株，產(chǎn)雙乙酰量分別為336、416 μgmL，相比出發(fā)菌株（296 μgmL）分別增加了135%、405%。通過對酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌這2株主要產(chǎn)香菌株產(chǎn)香特性的研究，為高產(chǎn)香酸奶的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：保加利亞乳桿菌；嗜熱鏈球菌；紫外誘變；乙醛；雙乙酰

中圖分類號： TS252文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0285-04

HJ14mm]

收稿日期：2016-06-20

基金項目：安陽工學院農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏重點學科項目。

作者簡介：杜磊（1980—），男，河南安陽人，碩士，講師，主要從事乳制品研究。E-mail：ayspwswx@163com。

近年來，隨著科學技術(shù)和人民生活水平的提高，人們對酸奶營養(yǎng)成分的關(guān)注意識逐步增強，對酸奶的外觀特性（風味、口感、品質(zhì)）也是越來越重視。但是酸奶具有良好的風味和營養(yǎng)價值，這無疑使其在快節(jié)奏的生活中占據(jù)了越來越重要的地位。各種各樣的添加劑賦予了酸奶良好的風味，但是人們更為擔心的是這些添加劑會給人帶來的負面影響，于是對乳酸菌的品質(zhì)提出了更高要求。菌株的發(fā)酵性能直接影響到酸奶的發(fā)酵質(zhì)量，對酸奶的產(chǎn)香也有很大的影響。應(yīng)用于乳制品加工的發(fā)酵微生物主要是乳酸菌，構(gòu)成牛乳主體香味的物質(zhì)主要是雙乙酰、乙醛、二甲硫醇、脂肪酸、酮類、內(nèi)酯等。其中，對乳制品香味起到主要調(diào)節(jié)作用的是雙乙酰和乙醛。嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌分別為雙乙酰和乙醛的主要產(chǎn)生菌種1-2]。本研究選取從市售酸奶中分離篩選出的產(chǎn)香性能較好的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為出發(fā)菌株，通過紫外誘變，篩選出高產(chǎn)香菌株，并將其應(yīng)用于酸奶發(fā)酵中，提高酸奶的品質(zhì)。

1材料與方法

11材料與試劑

菌株：從市售花花牛酸奶中分離得到保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。主要試劑：脫脂乳粉，食品級，內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司；花花牛酸奶，食品級，河南花花牛乳業(yè)有限公司；葡萄糖，分析純，天津北辰方正試劑廠；吐溫 80、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；磷酸氫二鉀、硫代硫酸鈉，分析純，天津市北方化玻購銷中心；乙酸鈉，分析純，北京北化化學品有限責任公司；硫酸鎂，分析純，北京57601化工廠；硫酸錳，分析純，河南焦作市化工三廠；鄰苯二胺，分析純，三遠化工有限公司。

12 儀器與設(shè)備

DZKW-S電熱恒溫水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；XSP-1C電子顯微鏡，浙江寧波市鎮(zhèn)海中華電子儀表廠；ZXGP-A2160電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；TU-1810DASPC分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；22331超高速冷凍離心機，德國艾本德股份公司；SW-CJ-2FD垂直流雙人單面超凈工作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；CBIO-UV8C紫外線誘變箱，北京賽百奧科技有限公司。

13試驗方法

該試驗的具體技術(shù)路線如下：從酸奶中分離出保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌3-5]，從中選出產(chǎn)雙乙酰和乙醛較好的菌株，經(jīng)過增菌培養(yǎng)富集菌體，再離心獲得菌體6]，通過不同條件的紫外線誘變7-14]得到誘變菌株，并對其產(chǎn)香性能進行測定15-20]，選出優(yōu)良產(chǎn)香菌株。

131主要培養(yǎng)基

1311脫脂乳培養(yǎng)基配制方法按1 g ∶10 mL的比例將適量的脫脂乳粉加蒸餾水溶解，密封置于滅菌鍋中115 ℃蒸汽滅菌10～15 min，經(jīng)高壓滅菌后置于冰箱中備用。

1312MRS培養(yǎng)基固體MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，牛肉膏10 g，瓊脂20 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉 5 g，葡萄糖 20 g，吐溫80 1 mL，硫酸鎂058 g，硫酸錳 025 g，蒸餾水 1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。液體MRS培養(yǎng)基的配制參照固體培養(yǎng)基，將上述固體MRS培養(yǎng)基中的瓊脂去掉。

1313M17培養(yǎng)基固體M17培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母浸膏5 g，硫酸鎂025 g，甘油10 g，乳糖3 g，磷酸氫二鉀5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1L。液體M17培養(yǎng)基只需將上述固體M17培養(yǎng)基中的瓊脂去掉。

132菌種分離

將菌種稀釋成不同稀釋梯度的菌懸液。用移液槍分別吸取10-4、10-5、10-6 3個試管中的菌懸液 01 mL 滴在MRS、M17 2種固體培養(yǎng)基表面中央位置，用無菌玻璃涂布棒將菌液均勻涂開，靜置數(shù)分鐘，使菌液浸入培養(yǎng)基。將平板倒置，放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)2 d。

133保加利亞乳桿菌的誘變前準備

用上步中得到的保加利亞乳桿菌菌株制作發(fā)酵劑，并活化3代，以2%接種量將菌種接入滅菌脫脂乳中，37 ℃培養(yǎng)16 h20]，通過檢測脫脂乳的酸度、產(chǎn)乙醛的量，確定產(chǎn)香性能好的菌株作為出發(fā)菌株。將純化的出發(fā)保加利亞乳桿菌菌種接種至配制的MRS液體培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h后每隔4 h取出2個試管作為平行組，滴定檢測其酸度，繪制保加利亞乳桿菌的生長曲線。根據(jù)上述繪制的生長曲線，選取對數(shù)生長之后的保加利亞乳桿菌培養(yǎng)液，在4 ℃下4 000 rmin離心 20 min，棄去上清液，用無菌水洗滌菌體，收集菌體并倒入平板，為誘變做準備。endprint

134保加利亞乳桿菌的紫外誘變

（1）將倒入平板的菌液于垂直距離紫外燈20 cm處下開蓋照射120 s，紫外線波長分別為254、365 nm。

（2）將倒入平板的菌液在波長為365 nm的情況下，豎直距離紫外燈15、20 cm處照射120 s誘變。

（3）將倒入平板的菌液于波長為365 nm，距離紫外燈20 cm處，分別照射60、120、180 s。

將未經(jīng)照射的和經(jīng)過紫外照射的菌液分別計數(shù)，計算致死率。致死率=（未照射菌數(shù)-照射后菌數(shù)）未照射菌數(shù)]×100%。從致死率90%左右的平板中，挑選5個單菌落，接種至脫脂乳中培養(yǎng)至凝乳，測定產(chǎn)乙醛性能。

135嗜熱鏈球菌的產(chǎn)香性能測定

將分離純化得到的嗜熱鏈球菌疑似菌株，活化3代后，接種至脫脂乳，42 ℃培養(yǎng) 14 h 后1]，檢測產(chǎn)雙乙酰的量，確定產(chǎn)雙乙酰量最多的作為出發(fā)菌株。

136嗜熱鏈球菌的誘變前準備及誘變

嗜熱鏈球菌的誘變前準備方法與保加利亞乳桿菌相同，只是將MRS培養(yǎng)基改為M17培養(yǎng)基。嗜熱鏈球菌接下來的操作參照保加利亞乳桿菌的處理。

14評價指標測定方法

保加利亞乳桿菌乙醛產(chǎn)量的檢測參照劉鵬等的檢測方法20]。嗜熱鏈球菌雙乙酰產(chǎn)量的檢測參照王丹等的檢測方法17]。用吉爾涅爾度（°T）來表示滴定酸度。采用MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基測定酸奶中乳酸菌總菌數(shù)。吸光度的測量采用分光光度計，波長335 nm。

2結(jié)果與分析

21菌種分離

通過菌種分離，得到了保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。分離效果見圖1、圖2。

FK（W12]TPDL1tif]

22保加利亞乳桿菌的誘變與檢測

221保加利亞乳桿菌產(chǎn)香菌株的初步篩選

從純化后的平板上取10個疑似目標菌落，活化3代以后，分別接種至脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，檢測其產(chǎn)乙醛的情況（表1）。

從表1可以看出，2號菌株的產(chǎn)乙醛量明顯優(yōu)于其他菌株，為（1265±017） μgmL，確定2號菌株為出發(fā)菌株。

222保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長曲線的繪制

保加利亞乳桿菌的生長曲線見圖3。從圖3可以看出，單個菌種的生長曲線都呈現(xiàn)先增加后平緩的趨勢，并且2個菌種都是在32 h左右滴定酸度的變化不再明顯，可以確定32 h為菌種繁殖量最大的時間點。選取32 h作為制備菌懸液的最佳時間。

223保加利亞乳桿菌的紫外誘變

按照前述的誘變方法，保加利亞乳桿菌的誘變結(jié)果見表2。隨著紫外波長的增大，致死率逐漸增大，因此選擇致死率最大的365 nm為最佳誘變劑量；垂直誘變距離為15 cm時的致死率相對較高，為935%，因此選擇15 cm為最佳誘變劑量；誘變時間為120 s時致死率相對較高，為984%，而且菌株生長更好，因此選擇120 s為最佳誘變劑量。綜上所述，保加利亞乳桿菌的最佳誘變參數(shù)為紫外波長365 nm、垂直誘變距離 15 cm、誘變時間120 s。

224誘變之后保加利亞乳桿菌的產(chǎn)香檢測

從誘變后篩選出的高死亡率的平板中分別挑出5個保加利亞乳桿菌菌株，接種至脫脂乳中活化3代，然后按2%的劑量接種到脫脂乳培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)16 h，菌株的產(chǎn)香情況見表3。

從表3可以看出， 誘變波長為365 nm時， 菌株的產(chǎn)乙醛量有升高也有降低，其中L-21、L-24的產(chǎn)乙醛量較出發(fā)菌株均下降；菌株L-22的產(chǎn)乙醛量相對較高，為最佳菌株。誘變距離為15 cm時，保加利亞乳桿菌的產(chǎn)乙醛量均有上升，其中菌株L-2a的產(chǎn)乙醛量最高，確定為最佳菌株。誘變時間為120 s時，保加利亞乳桿菌的產(chǎn)乙醛量有升高也有降低，其中菌株L-2D的產(chǎn)乙醛量最高，菌株L-2C的產(chǎn)乙醛量下降，確定L-2D為最佳菌株。

23嗜熱鏈球菌的誘變與檢測

231嗜熱鏈球菌產(chǎn)香菌株的初步篩選

從純化的平板上挑取10個嗜熱鏈球菌疑似菌株，活化3代后，按2%的接種量接種至脫脂乳中42 ℃培養(yǎng)14 h，檢測其產(chǎn)雙乙酰的情況（表4）。

從表4可以看出，1號菌株的產(chǎn)雙乙酰量相對較高，為（296±016） μgmL，因此確定S-1為出發(fā)菌株。

232嗜熱鏈球菌的紫外誘變

參照保加利亞乳桿菌的紫外誘變方法，嗜熱鏈球菌的誘變情況見表5。

從表5可以看出，紫外波長為365 nm的時候，菌株的致死率相對較高，為955%，因此確定波長365 nm為最佳誘變劑CM（25]量。當垂直照射距離為15 cm時，紫外誘變的致死率相對較高，為953%，因此選取垂直照射距離15 cm為最佳誘變劑量。誘變時間為120 s時，紫外誘變致死率高，為961%，因為選取120 s為最佳誘變劑量。綜上所述，嗜熱鏈球菌的最佳誘變參數(shù)為紫外波長365 nm、垂直照射距離15 cm、誘變時間120 s。

233誘變之后嗜熱鏈球菌的產(chǎn)香檢測

從誘變后致死率高的平板中分別挑出5個疑似嗜熱鏈球菌菌株，接種至脫脂乳中活化3代，然后按2%的劑量接種到脫脂乳培養(yǎng)基，42 ℃下培養(yǎng)14 h，菌株的產(chǎn)香情況見表6。

從表6可以看出，紫外誘變波長為365 nm時，各個菌株的產(chǎn)雙乙酰量均有所增加，其中S-14的產(chǎn)雙乙酰量最高，所以選取S-14作為最佳菌株。垂直照射距離為15 cm時，各個菌株的產(chǎn)雙乙酰量均有所增加，其中菌株S-1d的產(chǎn)雙乙酰量明顯最高，所以選取S-1d為最佳菌株。誘變時間為120 s時，各個菌株的產(chǎn)雙乙酰量均有所下降，特別是S-1C菌株，產(chǎn)雙乙酰量最少。

3結(jié)論endprint

（1）從市售花花牛酸奶中通過菌種分離和產(chǎn)香檢測，篩選出高產(chǎn)乙醛的L-2菌株和高產(chǎn)雙乙酰的S-1菌株作為出發(fā)菌株，其中L-2的產(chǎn)乙醛量為1265 μgmL，S-1的產(chǎn)雙乙酰量為296 μgmL。

（2）通過確定最佳誘變參數(shù)（紫外照射波長365 nm、垂直照射距離15 cm、紫外照射時間120 s），篩選出了保加利亞乳桿菌L-22、L-2a、L-2D為3個誘變情況下產(chǎn)乙醛量最高的菌株，產(chǎn)量分別為1351、1652、1446 μgmL，相比出發(fā)菌株L-2，分別增加了68%、306%、143%。

（3）與保加利亞乳桿菌同樣的誘變劑量，篩選出了嗜熱鏈球菌S-14、S-1d的產(chǎn)雙乙酰量分別為336、416 μgmL，較出發(fā)菌株分別增加了135%、405%。在產(chǎn)量出現(xiàn)降低的菌株中，S-1C的產(chǎn)雙乙酰量最少，為 188 μgmL，相比出發(fā)菌株降低了365%，表明紫外誘變存在不定向性，有些菌株經(jīng)過紫外誘變后，會出現(xiàn)產(chǎn)香性能下降的現(xiàn)象。

（4）本試驗通過對分離得到的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進行誘變和產(chǎn)香檢測，并與出發(fā)菌株進行比較，得到了產(chǎn)香增加的菌株，為生產(chǎn)更具優(yōu)良風味和營養(yǎng)價值的酸奶提供了依據(jù)。

（5）本試驗采用碘滴定法和鄰苯二胺比色法檢測乙醛和雙乙酰，避免了制作標準曲線的繁瑣，通過前后量的對比，使結(jié)果更直觀明了。

參考文獻：

1]ZK（#]李勇，董翠芳，歐國兵 乳酸菌產(chǎn)香機理和特性的研究J] 新疆畜牧業(yè)，2008（4）：55-61

2]魏小雁，冀林立，劉建軍，等 酸奶發(fā)酵劑菌種的產(chǎn)香物質(zhì)及發(fā)酵特性研究J] 乳業(yè)科學與技術(shù)，2008，31（1）：21-23，31

3]侯小歌，郭翠紅，金剛，等 酸奶中傳統(tǒng)發(fā)酵乳酸菌的分離篩選及增菌研究J] 安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（13）：5854-5856，5930

4]汪川，張朝武，余倩 酸奶中保加利亞乳桿菌分離條件的優(yōu)化J] 中國微生態(tài)學雜志，2001，13（2）：73-74，80

5]彭磊，司紅麗 酸奶中嗜熱鏈球菌初步分離與鑒定J] 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（15）：359-360HJ175mm]

6]霍艷榮 高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌菌株的選育及其在酸奶生產(chǎn)中的應(yīng)用D] 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2003

7]梁金鐘，李雯，王風青 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及誘變育種J] 食品科學，2013，34（23）：228-232

8]趙士豪，馬同鎖，路新利，等 酸奶生產(chǎn)菌株的誘變選育J] 生物技術(shù)，2005，15（5）：22-24

9]朱朝陽 L-乳酸高產(chǎn)菌株的誘變選育D] 洛陽：河南科技大學，2011

10]ZK（#]帖金鑫，霍乃蕊 嗜酸乳桿菌乳酸高產(chǎn)菌株的紫外誘變選育J] 食品工程，2012，22（2）：38-40

11]韓雪，張?zhí)m威，張爽，等 弱后酸化酸奶發(fā)酵菌株的紫外誘變選育J] 中國釀造，2011，10（1）：127-130

12]李小平，魏玲玲，張慧發(fā)，等 保加利亞乳桿菌乳酸高產(chǎn)菌株的紫外誘變選育J] 山西農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2010，30（1）：88-90

13]Murao K，Kaneko S，Suzuki T A cold-sensitive mutant of Lactobacillus delbrueckii subsp bulgarieus and its application to yoghurt manufacturing inter dairyJ] Congress，1990（17）：180-184

14]車黎猛，任發(fā)政，陳尚武 抗后酸化保加利亞乳桿菌的紫外誘變選育J] 食品科學，2006，27（6）：109-112

15]劉寧寧，郭紅敏，葛春美，等 酸奶中乙醛和雙乙酰含量對其風味的影響J] 中國食品添加劑，2012（增刊1）：269-273

16]李妍，邢慧敏，邵亞東，等 發(fā)酵乳中丁二酮和乙醛含量檢測方法探討J] 食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（3）：157-159

17]王丹，劉鵬 酸奶中聯(lián)乙酰含量測定方法的初步探討J] 中國乳品工業(yè)，1992（2）：60-63

18]張嵐 高產(chǎn)乙醛的嗜熱鏈球菌在發(fā)酵乳中的應(yīng)用研究D] 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2014：31

19]康歡 酸奶中風味物質(zhì)與酶活及感官特性關(guān)系的初探D] 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2013：19-35

20]劉鵬，任新宇，王丹，等 酸奶中乙醛含量測定方法的初步探討J] 中國乳品工業(yè)，1992，20（4）：151-154endprint