田 雪，龐小磊，王良炎，顧 靚，郭生強(qiáng)，李學(xué)軍

( 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 河南 新鄉(xiāng) 453007 )

MITFa及TYR基因在紅色錦鯉體色發(fā)生不同階段的表達(dá)分析

田 雪，龐小磊，王良炎，顧 靚，郭生強(qiáng)，李學(xué)軍

( 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 河南 新鄉(xiāng) 453007 )

本研究描述了紅色錦鯉從出膜到體色形成的過程，總結(jié)和歸納不同發(fā)育階段體色變化異同點(diǎn)，篩選出6個(gè)體色變化較顯著時(shí)期，分別為1、2、3、4、12、48 日齡。利用熒光定量PCR分析MITFa及TYR基因在紅色錦鯉6個(gè)體色變化時(shí)期的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，MITFa基因在1日齡時(shí)表達(dá)量最高，顯著高于48日齡時(shí)(P<0.05)，極顯著高于其他4個(gè)時(shí)期(P<0.01)。48日齡時(shí)表達(dá)量次之，亦極顯著高于2、3、4、12日齡 4個(gè)時(shí)期(P<0.01)。2、3、4、12日齡 4個(gè)時(shí)期MITFa基因表達(dá)量較低且不存在顯著差異(P>0.05)。TYR基因在1日齡時(shí)表達(dá)量最高(P<0.01)，4日齡時(shí)表達(dá)量顯著高于12、48日齡(P<0.05)，與2、3日齡不存在顯著差異(P>0.05)。TYR基因表達(dá)量在2、3、12、48日齡 4個(gè)時(shí)期差異不顯著(P>0.05)。MITFa和TYR基因在紅色錦鯉體色形成過程中，表達(dá)水平整體呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，其中MITFa基因表達(dá)量表現(xiàn)為先降后升，TYR基因則先降后升再降。以上結(jié)果顯示MITFa、 TYR基因與錦鯉體色形成具有一定相關(guān)性，但MITFa和TYR基因在體色發(fā)生中的相互作用還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

紅色錦鯉；MITFa；TYR；表達(dá)分析；體色發(fā)生

魚類體色豐富多彩，種類、性別、個(gè)體差異、甚至個(gè)體發(fā)育的不同階段和部位都可能表現(xiàn)出不同顏色。除了種類、生理生化因素使魚類體色產(chǎn)生差異，其生存的水域環(huán)境，攝食的餌料等一系列因素也可影響魚類體色的形成[1-2]。環(huán)境、理化因子對(duì)魚類體色的影響主要因其皮膚和鱗片上的色素細(xì)胞種類、數(shù)量和分布不同所致[3-6]。魚類具有6種色素細(xì)胞，分別是黑色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞、白色素細(xì)胞和藍(lán)色素細(xì)胞。6種色素細(xì)胞含有不同的色素顆粒，色素顆粒的顏色、反光作用和運(yùn)動(dòng)遷移，使魚類呈現(xiàn)從白到黑的多種顏色[7]。

魚類色素細(xì)胞由神經(jīng)嵴細(xì)胞分化形成，大量基因參與神經(jīng)嵴細(xì)胞向色素細(xì)胞的遷移和分化[8]。MITF基因是黑色素細(xì)胞分化形成的重要轉(zhuǎn)錄因子，在魚類色素細(xì)胞分化和成熟過程中發(fā)揮重要作用。TYR是黑色素合成的關(guān)鍵限速酶，調(diào)控黑色素顆粒的生成，MITF基因結(jié)合在下游TYR基因啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)TYR基因的表達(dá)[9-12]。

錦鯉(Cyprinuscarpio)，屬鯉形目、鯉科、鯉屬，是鯉魚人工選育過程形成的觀賞品種[13-14]。作為高檔觀賞魚，錦鯉在其體色鑒賞上已形成一定系統(tǒng)[15]，常見種類主要包括紅白、大正三色、別光等。但是，這些類型體色多成斑塊狀或鑲嵌型，遺傳背景復(fù)雜。因此，本試驗(yàn)選用體色單一的紅色錦鯉作為研究對(duì)象，觀察其體色發(fā)生過程，并對(duì)其個(gè)體發(fā)育不同階段MITFa和TYR基因進(jìn)行熒光定量分析，探索MITFa和TYR基因與錦鯉體色發(fā)生的關(guān)系，為研究錦鯉體色形成機(jī)制提供理論依據(jù)，也為魚類色素細(xì)胞系的建立提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚

2015年3月從河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地挑選性腺發(fā)育良好的紅色錦鯉親魚6尾(♀∶♂=1∶1)進(jìn)行人工干法授精，受精卵置于孵化桶孵化，用于仔魚體色發(fā)生觀察。

1.2 仔魚體色發(fā)生觀察和樣品收集

仔魚出膜后，0～25 日齡每日觀察、取樣一次，25～60 日齡每2 d取樣一次。隨機(jī)取樣30尾仔魚，10尾在OLYMPUS BX51研究級(jí)顯微鏡下觀察、拍照，20尾用RNAlater(Life technologies公司，美國(guó))保存于-80 ℃，用于RNA提取。

1.3 總RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增

依據(jù)體色發(fā)生觀察結(jié)果，對(duì)1、2、3、4、12、48日齡的紅色錦鯉仔魚進(jìn)行RNA提取，1%瓊脂糖凝膠電泳和ND-2000核酸蛋白儀檢測(cè)RNA完整性、純度和OD值。PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara公司，大連)合成cDNA用于PCR擴(kuò)增。

利用Primer3Plus在線軟件設(shè)計(jì)MITFa和TYR引物(http://www.primer3plus.com/)(表1)，由蘇州金唯智生物公司合成。取適量cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，連接pMD18-T載體(Takara公司，大連)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選及雙酶切驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆送蘇州金唯智生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 試驗(yàn)用PCR 引物及序列

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)

參照TaKaRa熒光定量PCR試劑盒說明書(TaKaRa，大連)，將6個(gè)發(fā)育階段的紅色錦鯉cDNA作為模板，設(shè)3個(gè)重復(fù)，體系為10 μL: 上下游引物各0.3 μL，SYBR Premix Ⅱ TaqTM(2×) 5 μL，cDNA 1 μL，RNase free H2O 3.4 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，62 ℃ 20 s， 40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束分析溶解曲線和Ct值，2-△△Ct法計(jì)算每個(gè)階段MITFa和TYR基因的相對(duì)表達(dá)水平，△Ct=Ct目的基因-Ctβ-actin，△△Ct=(Ct目的基因-Ctβ-actin)試驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ctβ-actin)對(duì)照組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 20.0單因素方差分析表達(dá)量數(shù)據(jù)并進(jìn)行LSD和Duncan氏比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 紅色錦鯉體色發(fā)生觀察

紅色錦鯉出膜前時(shí)期，受精卵依靠卵黃囊提供能量用來發(fā)育，此時(shí)胚胎呈現(xiàn)卵黃囊顏色，表現(xiàn)為微弱黃色。1日齡仔魚除眼部呈現(xiàn)黑色外，其他部位無色素細(xì)胞，魚苗整體表現(xiàn)為無色透明。仔魚發(fā)育至2日齡，顯微鏡下可觀察到體色變化，色素細(xì)胞集中在錦鯉背部，從頭部逐漸向尾部擴(kuò)散。發(fā)育至3日齡，仔魚背部顏色加深，腹部開始出現(xiàn)色素細(xì)胞。4日齡，色素細(xì)胞完全分布在背部及腹部。5～14日齡，體色逐漸加深，發(fā)育至48日齡，鱗片完全形成，魚體呈現(xiàn)紅色，基本同成魚顏色一致(圖1)。

圖1 不同發(fā)育時(shí)期的紅色錦鯉a，1日齡； b，2日齡；c，3日齡；d，4日齡；e，12日齡；f，48日齡.1，背部；2，腹部；3，眼.

2.2 錦鯉體色發(fā)生過程中MITFa基因的表達(dá)

通過紅色錦鯉的體色發(fā)生觀察，篩選出6個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。檢測(cè)MITFa基因在1、2、3、4、12、48日齡的表達(dá)情況，熒光定量PCR結(jié)果顯示，MITFa基因在1日齡時(shí)表達(dá)量是1.053±0.409，顯著高于48日齡(P<0.05)，1、48 日齡 MITFa表達(dá)量均極顯著高于其他4個(gè)時(shí)期(P<0.01)。12日齡時(shí)表達(dá)量最低，但與2、3、4日齡 3個(gè)發(fā)育階段不存在顯著差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 錦鯉體色發(fā)生過程中MITFa基因的表達(dá)

2.3 錦鯉體色發(fā)生過程中TYR基因的表達(dá)

熒光定量PCR結(jié)果顯示，TYR基因在紅色錦鯉上述6個(gè)體色發(fā)生階段的表達(dá)情況整體呈降低趨勢(shì)。1日齡TYR基因表達(dá)量是1.088±0.572，極顯著高于其他5個(gè)時(shí)期(P<0.01)，4日齡表達(dá)量顯著高于12日齡、48日齡(P<0.05)，而與2日齡、3日齡這兩個(gè)時(shí)期不存在顯著差異(P>0.05)，2、3、12、48日齡 4個(gè)時(shí)期TYR基因表達(dá)量不存在顯著差異(P>0.05)，48日齡 TYR基因的表達(dá)量最低，為0.0388±0.00613(圖3)。

圖3 錦鯉體色發(fā)生過程中TYR基因的表達(dá)

3 討 論

3.1 紅色錦鯉不同發(fā)育時(shí)期體色發(fā)生觀察

利用顯微觀察方法對(duì)紅色錦鯉出膜前、出膜后及體色完全形成等一系列體色發(fā)生過程進(jìn)行了詳細(xì)描述。出膜前時(shí)期受精卵依靠卵黃囊提供能量進(jìn)行發(fā)育，胚胎呈現(xiàn)卵黃囊顏色，表現(xiàn)為微弱黃色，與一般魚類胚胎顏色相近[4]。出膜后1日齡仔魚除眼部呈現(xiàn)黑色，其他部位無色素細(xì)胞，身體透明，可能是魚體內(nèi)色素細(xì)胞還未開始分化發(fā)育或剛開始分化，色素顆粒尚未合成，導(dǎo)致整體表現(xiàn)為無色透明[16]。發(fā)育至2日齡，隨著黃色素和紅色素細(xì)胞不斷分化、發(fā)育，可在顯微鏡下觀察到體色變化，色素細(xì)胞集中呈現(xiàn)于錦鯉背部，從頭部逐漸向尾部擴(kuò)散[17]。這說明色素細(xì)胞分化存在時(shí)空差異，隨著時(shí)間發(fā)展，不斷向尾部遷移擴(kuò)散[18]。仔魚發(fā)育至3日齡，背部顏色加深，腹部開始出現(xiàn)色素細(xì)胞，這可能是由于色素細(xì)胞分化的同時(shí)，伴隨著色素顆粒的合成和積累。Hultman等[19]研究證實(shí)魚類色素細(xì)胞是由神經(jīng)嵴細(xì)胞通過背腹軸模式遷移，本研究中紅色錦鯉體色發(fā)生同樣存在背腹軸模式。發(fā)育至4日齡，色素細(xì)胞完全分布在背部及腹部，同樣也是黃色素細(xì)胞和紅色素細(xì)胞相互作用的過程[20]。5～14日齡，隨著色素顆粒的沉著，體色逐漸加深。發(fā)育至48日齡，鱗片完全形成，魚體呈現(xiàn)紅色，基本同成魚顏色一致。

3.2 MITFa基因和TYR基因在發(fā)育過程中的表達(dá)差異

MITFa基因在紅色錦鯉體色發(fā)生的6個(gè)時(shí)期均有一定量的表達(dá)。這與Liu等[12]研究結(jié)果相似，即在無黑色素細(xì)胞的錦鯉囊胚、剛出膜仔魚、紅白錦鯉和黃金錦鯉中均檢測(cè)到MITFa基因。已有的研究表明，MITFa基因不僅參與黑色素細(xì)胞發(fā)育與分化，而且在體色形成相關(guān)的非黑色素細(xì)胞分化及成體體色維持中扮演重要角色[9]。發(fā)育至1日齡， MITFa基因表達(dá)量最高，可能是由于色素前體細(xì)胞向色素細(xì)胞分化過程中MITFa基因發(fā)揮一定作用導(dǎo)致[11]。隨著色素細(xì)胞不斷分化成熟，色素細(xì)胞遷移和擴(kuò)散逐漸減慢，MITFa基因表達(dá)水平也呈降低趨勢(shì)[21]。

TYR是一種廣泛存在于植物、動(dòng)物和細(xì)菌中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要存在于黑色素小體中，僅有一小部分在細(xì)胞質(zhì)。TYR基因在紅色錦鯉體色發(fā)生階段都有存在，與王巍等[10,22]研究結(jié)果相似。甌江彩鯉、純色及黑色斑塊錦鯉皮膚中均存在TYR基因的表達(dá)，說明TYR不僅在黑色素細(xì)胞中起作用，在其他類型色素細(xì)胞中也發(fā)揮一定功能[23]。MITFa和TYR基因均在1日齡表達(dá)量達(dá)到最高，顯著高于其他5個(gè)時(shí)期，進(jìn)一步表明在紅色錦鯉體色形成初期，MITFa基因?qū)YR具有上調(diào)效應(yīng)。隨著體色的形成，MITFa基因表達(dá)量呈遞減趨勢(shì)，TYR基因表達(dá)量同樣表現(xiàn)為逐漸降低。但4日齡TYR基因表達(dá)量相對(duì)增加，原因可能由于錦鯉體內(nèi)存在多種酪氨酸酶形式，部分抑制狀態(tài)在這個(gè)時(shí)期被激活，導(dǎo)致表達(dá)量增高[24- 25]。

近年來，關(guān)于錦鯉體色研究主要集中在色素著色物質(zhì)及理化因素對(duì)魚類體色的影響方面[1-2,26-27]，而對(duì)于色素相關(guān)基因的研究大多從黑色素細(xì)胞色素合成關(guān)鍵基因入手，涉及色素細(xì)胞遷移和分化的研究，較為鮮見[9-10,12]，關(guān)于MITF及TYR基因的研究主要集中在哺乳動(dòng)物黑色素細(xì)胞方面[28]，MITF基因可調(diào)控酪氨酸基因家族的表達(dá)，從而參與黑素生成的調(diào)控， MITF基因在生物體內(nèi)能調(diào)控黑色素合成關(guān)鍵限制酶——酪氨酸酶基因的表達(dá)，影響黑色素細(xì)胞的分化[29]。關(guān)于這兩個(gè)基因在魚類不同發(fā)育階段的研究較少，如Darias等[30]在其研究中所報(bào)道的那樣，塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)不同發(fā)育階段過程中，MITF基因的表達(dá)也表現(xiàn)為先降后升的趨勢(shì)，同時(shí)TYR基因的表達(dá)也表現(xiàn)為兩個(gè)峰值，且其表達(dá)趨勢(shì)也與在錦鯉中的表達(dá)顯示出一定的相似性。但這兩種基因?qū)τ谄渌丶?xì)胞分化和形成是否起作用，以及如何發(fā)揮功能均未見報(bào)道。

錦鯉色素調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，關(guān)于錦鯉色素調(diào)控通路、色素細(xì)胞的相互作用及其模式形成已開展相關(guān)研究[8, 19, 31-33]。在這些研究中也都提及色素細(xì)胞的調(diào)控不是由單因素決定，但對(duì)于參與黑色素細(xì)胞形成及色素合成的調(diào)控基因是否在其他類型色素細(xì)胞中發(fā)揮作用，所開展的研究相對(duì)較少。本研究對(duì)錦鯉體色發(fā)生過程進(jìn)行顯微觀察，并分析MITFa和TYR基因在錦鯉體色發(fā)生過程中的表達(dá)水平，為將來深入研究色素形成相關(guān)基因在錦鯉體色形成的作用提供基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，但MITFa和TYR基因在非黑色素細(xì)胞中的作用及相互關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本研究通過顯微觀察技術(shù)，對(duì)紅色錦鯉體色發(fā)生過程進(jìn)行了詳細(xì)觀察，從中篩選出6個(gè)體色變化較顯著的時(shí)期, 并對(duì)這6個(gè)時(shí)期中MITFa及TYR基因的表達(dá)進(jìn)行熒光定量分析，確定了這兩個(gè)色素關(guān)鍵基因的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示MITFa、TYR基因與紅色錦鯉體色形成具有一定相關(guān)性，但MITFa和TYR基因在體色發(fā)生中的相互作用還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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ExpressionofMITFaandTYRGeneinBodyColorFormationinRedColorKoiCarpCyprinuscarpioatDifferentStages

TIAN Xue, PANG Xiaolei, WANG Liangyan, GU Liang, GUO Shengqiang, LI Xuejun

( College of Fisheries, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China )

This study described the process of the color formation in koi carpCyprinuscarpiowith red color from hatching to whole body color formation. We summarized and concluded the distinct changes in body color during pigmentation development and selected 6 obvious stages of pigmentation ontogenesis, including 1, 2, 3, 4, 12 and 48 dph (day post hatching), respectively. We assessed the expression of the MITFa (Microphthalmia-associtated Transcription Factor) and TYR (TYRosinase) gene in 6 stages by quantitative real-time PCR. The results showed that the expression level of MITFa was the maximum in 1 dph, higher than 48 dph (P<0.05) and significantly higher than other four stages (P<0.01). In addition, there was no significant difference among 2, 3, 4 and 12 dph (P>0.05). Also, the TYR gene was most highly expressed in the 1 dph (P<0.01). And in the 4 dph, TYR expression was significantly higher than the 12 dph and 48 dph, but no difference with 2 dph and 3 dph. There was no significant difference in TYR among the 2, 3, 12 and 48 dph (P>0.05). In conclusion, both MITFa and TYR gene expression trend were identified to decline associated with pigmentation development in koi carp with red color. The expression of MITFa gene was declined firstly and subsequently rised. But the expression trend of TYR gene was fluctuantly changed, which initially exhibited decreased and then reduced again. The findings indicated that the MITFa, and TYR gene had a relationship with the body color formation in koi carp, but the interaction between MITFa and TYR in the color formation remains to be further studied.

Cyprinuscarpio; MITFa; TYR; expression analysis; body color formation

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.014

2016-04-08；

2016-06-12.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31402294)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410476006)；河南省國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(152102410040)；河南師范大學(xué)博士科研啟動(dòng)費(fèi)支持項(xiàng)目(qd13056).

田雪(1981-)，女，講師；研究方向：魚類體色調(diào)控研究. E-mail: tianxue_81@126.com. 通訊作者：李學(xué)軍(1967-)，男，教授；研究方向：魚類遺傳育種. E-mail: xjli@htu.cn.

S965.8

A

1003-1111(2017)02-0197-05