沈煒 陳學(xué)奇

調(diào)經(jīng)湯對(duì)卵巢早衰模型大鼠卵巢功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

沈煒1陳學(xué)奇2

目的觀察調(diào)經(jīng)湯對(duì)卵巢早衰模型大鼠卵巢功能的影響。方法將60只雌性成熟未交配Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組、調(diào)經(jīng)湯低、中、高劑量組，每組10只。空白組大鼠按0.4mL/100g體質(zhì)量腹腔注射無(wú)菌注射用水，其余各組大鼠按0.4mL/100g體質(zhì)量腹腔注射濃度為0.5mg/mL的順鉑溶液，連續(xù)7天。觀察大鼠行為變化、動(dòng)情周期，采用放射免疫法檢測(cè)大鼠血清促卵泡生成素（FSH）、雌激素（E2）和促黃體生成素（LH）水平，光鏡觀察卵巢組織形態(tài)改變。結(jié)果模型組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組大鼠無(wú)穩(wěn)定的動(dòng)情周期，調(diào)經(jīng)湯中、高劑量組逐漸恢復(fù)規(guī)律的動(dòng)情周期。給藥后第7、14天，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清FSH、LH升高，E2降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[第7天：（7.38±0.99）IU/L比（6.18±0.24）IU/L，（3.35±0.27）ng/L比（2.79±0.24）ng/L，（94.04±6.22）ng/L比（109.10±5.69）ng/L，P均＜0.05；第14天：（8.01±0.13）IU/L比（6.97±0.88）IU/L，（4.22±0.82）ng/L比（3.20±0.17）ng/L，（131.74±23.65）ng/L比（157.82±5.68）ng/L，P均＜0.05]；給藥后第7天，與模型組比較，調(diào)經(jīng)湯低、中、高劑量組大鼠血清FSH降低，E2升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（5.72±0.51）IU/L、（6.20±1.05）IU/L、（6.08±0.26）IU/L比（7.38±0.99）IU/L；（104.46±10.25）ng/L，（104.48±12.85）ng/L，（106.64±8.67）ng/L比（94.04±6.22）ng/L，P均＜0.05]；血清LH含量水平雖降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（2.96±0.38）ng/L、（3.00±0.19）ng/L、（2.96±0.23）ng/L比（3.35±0.27）ng/L，P＞0.05]。給藥后第14天，與模型組比較，調(diào)經(jīng)湯中劑量組大鼠血清FSH、LH降低，E2升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（7.02±1.04）IU/L比（8.01±0.13）IU/L，（3.37±0.53）ng/L比（4.22±0.82）ng/L，（153.67±20.55）ng/L比（131.74±23.65）ng/L，P均＜0.05]。模型組大鼠卵巢萎縮，卵泡生長(zhǎng)少，閉鎖卵泡增加，部分被纖維組織代替，黃體數(shù)量少，子宮內(nèi)膜明顯變薄。調(diào)經(jīng)湯低、中、高劑量組大鼠卵泡數(shù)量和黃體數(shù)目不同程度增多，子宮內(nèi)膜有所增厚。結(jié)論調(diào)經(jīng)湯能有效改善順鉑誘導(dǎo)的卵巢早衰模型大鼠的卵巢功能。

大鼠；卵巢早衰；調(diào)經(jīng)湯；順鉑

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指婦女在40歲之前由于卵巢功能提前衰竭而導(dǎo)致閉經(jīng)的現(xiàn)象[1-2]。POF臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為年齡＜40歲，閉經(jīng)時(shí)間≥4個(gè)月，間隔1個(gè)月以上的兩次血清促卵泡激素＞40mIU/mL，雌二醇（E2）＜73.2pmol/L，且超聲波顯示卵巢和子宮縮小，卵巢中無(wú)卵泡[3]?！罢{(diào)經(jīng)湯”源自陳木扇女科經(jīng)典著作《陳素庵婦科補(bǔ)解》中的“大調(diào)經(jīng)丸”，由當(dāng)歸、川芎、麩白芍、熟地黃、白術(shù)等組成。經(jīng)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，調(diào)經(jīng)湯能延長(zhǎng)女性的絕經(jīng)年齡，重建規(guī)律的月經(jīng)周期，改善早衰女性的卵巢功能。本文旨在通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，初步探索調(diào)經(jīng)湯治療卵巢早衰可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物成熟雌性未交配Wistar大鼠60只，體質(zhì)量180～220g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 藥物及試劑調(diào)經(jīng)湯組成：當(dāng)歸、川芎、麩白芍、熟地黃、白術(shù)等十六味中藥（浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)鑒定為合格的中藥飲片）。注射用順鉑（凍干型）（齊魯制藥有限公司，批號(hào)1507112）；0.9%氯化鈉注射液（杭州民生藥業(yè)有限公司，批號(hào)1503571）；HE染色液（三明市和眾生物技術(shù)有限公司，批號(hào)1410068）；戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)1511085）；

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 調(diào)經(jīng)湯提取液制備取單帖處方劑量的“調(diào)經(jīng)湯”飲片，用10倍量（體積/重量）水浸泡30min，然后煎煮1h，濾過(guò)得一次水提液；濾渣再加8倍量（體積/重量）水煎煮40min，濾過(guò)得二次水提液。合并兩次濾液，常壓濃縮至5、2.5、1.25g/mL，分別用于調(diào)經(jīng)湯高、中、低劑量組。

2.2 動(dòng)物分組與喂養(yǎng)將60只Wistar大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組、調(diào)經(jīng)湯低、中、高劑量組，每組10只。用苦味酸分別標(biāo)記，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)的IVE籠具中，相對(duì)濕度50%～70%，溫度22℃±1℃，12h明暗交替，15～20次/h的換風(fēng)次數(shù)，噪音小于50d。

2.3 卵巢早衰大鼠模型建立[4]空白組大鼠按0.4mL/100g體質(zhì)量腹腔注射無(wú)菌注射用水，其余各組大鼠按0.4mL/100g體質(zhì)量腹腔注射濃度0.5mg/mL順鉑溶液，連續(xù)7天，造成免疫性卵巢早衰大鼠模型。

2.4 給藥造模24h后開(kāi)始分組給藥，空白對(duì)照組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組給予濃度為1.25mg/100mL的雌二醇溶液；治療組分別給予低劑量（0.5g/100g體質(zhì)量）、中劑量（1g/100g體質(zhì)量）、高劑量（2g/100g體質(zhì)量）調(diào)經(jīng)湯水煎液灌胃均1天2次，連續(xù)14天。

2.5 觀察指標(biāo)及方法

2.5.1 各組大鼠行為學(xué)變化在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天觀察各組大鼠飲食量、活動(dòng)量、體毛、反應(yīng)和大便性狀等外在表現(xiàn)的差異。

2.5.2 各組大鼠動(dòng)情周期變化在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天定時(shí)取各組大鼠陰道分泌物，做陰道涂片，置于顯微鏡下觀察六組大鼠的動(dòng)情周期變化。

2.5.3 各組大鼠血清性激素變化分別于給藥第7、14天，禁食不禁水12h以上，眼眶內(nèi)眥取血，靜置后離心（3000r/min）20min，取上清液送檢，用放免法測(cè)定血清性激素水平。

2.5.4 卵巢組織形態(tài)學(xué)變化治療14天后將大鼠斷頸處死后剖腹取卵巢、子宮，置于中性甲醛液中固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察大鼠卵巢組織形態(tài)變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用單因素方差分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 行為學(xué)變化實(shí)驗(yàn)前后對(duì)比，空白對(duì)照組大鼠無(wú)明顯異常表現(xiàn)，狀態(tài)良好，行為敏捷，皮毛光滑，大便性狀良好。造模后，模型組大鼠的體質(zhì)量均明顯減輕，且隨著造模時(shí)間的推移，絕大部分大鼠進(jìn)食逐漸減少，形體逐漸消瘦，反應(yīng)變得遲鈍，蜷縮扎堆，皮毛暗淡，毛發(fā)蓬松，大便性狀發(fā)生變化，變得濕軟，臭味明顯加重。藥物治療后，陽(yáng)性藥物對(duì)照組大鼠恢復(fù)最慢，調(diào)經(jīng)湯組大鼠活動(dòng)量逐漸增加，進(jìn)食逐漸增多，大便性狀逐漸往正常水平恢復(fù)，其中屬高劑量調(diào)經(jīng)湯組大鼠恢復(fù)最佳。

3.2 動(dòng)情周期變化造模前，各組大鼠的動(dòng)情周期均為3～5天，動(dòng)情間期、動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期交替出現(xiàn)。各期陰道脫落細(xì)胞變化表現(xiàn)為動(dòng)情間期/靜止期：大部分為白細(xì)胞，混有少量較小的有核扁平上皮細(xì)胞；動(dòng)情前期：大部分為膨大的橢圓形有核上皮細(xì)胞；動(dòng)情期：膨大的上皮細(xì)胞消失，成為鱗狀脫落的角化上皮細(xì)胞；動(dòng)情后期：出現(xiàn)卵原細(xì)胞并逐漸增多。造模7天后，空白對(duì)照組大鼠動(dòng)情周期穩(wěn)定，為3～5天；其余五大組大鼠動(dòng)情周期紊亂，失去正常動(dòng)情周期變化，表現(xiàn)為持續(xù)的動(dòng)情間期、無(wú)動(dòng)情前期及動(dòng)情期，周期延長(zhǎng)至5～8天，陰道涂片可見(jiàn)白細(xì)胞、上皮細(xì)胞和角化的上皮細(xì)胞。治療14天后，調(diào)經(jīng)湯低、中劑量組大鼠動(dòng)情周期逐漸縮短為5～7天，其中調(diào)經(jīng)湯高劑量組大鼠動(dòng)情周期為4～6天。見(jiàn)封三圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)第12天各組大鼠陰道脫落細(xì)胞圖（Giemsa染色，×100）

圖2 各組大鼠卵巢組織形態(tài)（HE染色，×200）

3.3 血清性激素含量變化給藥7天后，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清FSH和LH水平升高，E2含量降低（P均＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性藥物對(duì)照組、調(diào)經(jīng)湯低、中、高劑量組大鼠血清FSH明顯降低，E2含量顯著升高（P均＜0.05）。給藥14天后，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清FSH和LH升高、E2含量降低（P均＜0.05）；陽(yáng)性藥物對(duì)照組大鼠血清E2含量降低（P＜0.05）。與模型組比較，調(diào)經(jīng)湯中劑量組大鼠血清FSH和LH含量降低、E2含量升高（P＜0.05），調(diào)經(jīng)湯高劑量組大鼠血清FSH含量降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

3.4 卵巢組織形態(tài)學(xué)變化空白對(duì)照組大鼠卵泡數(shù)量多，顆粒細(xì)胞層次多，各級(jí)卵泡類型明顯，黃體發(fā)育好，體積大，數(shù)量多，子宮內(nèi)膜厚。模型組大鼠卵巢體萎縮，卵泡生長(zhǎng)少，未見(jiàn)成熟的卵泡，閉鎖卵泡增加，部分被纖維組織代替，黃體數(shù)量少。陽(yáng)性藥物對(duì)照組大鼠卵巢體萎縮未見(jiàn)明顯恢復(fù)，卵泡生長(zhǎng)略有所增多，未見(jiàn)成熟卵泡，閉鎖卵泡略減少，黃體數(shù)量略增多；調(diào)經(jīng)湯各組大鼠均有明顯好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，成熟卵泡數(shù)量明顯增加，卵泡液含量也有所增多，黃體數(shù)目明顯增多，體積變大，其中屬調(diào)經(jīng)湯高劑量組大鼠恢復(fù)最明顯。各組大鼠卵巢組織形態(tài)見(jiàn)封三圖2。

4 討論

雌激素能促使細(xì)胞合成DNA、RNA和相應(yīng)組織內(nèi)各種不同的蛋白質(zhì)，從而促使子宮內(nèi)膜增生，增強(qiáng)子宮平滑肌的收縮，臨床用于治療卵巢機(jī)能不全或卵巢激素不足引起的各種癥狀。但是17β-雌二醇在體內(nèi)有抑制LH分泌的作用[5]，會(huì)推遲卵泡生長(zhǎng)。本研究顯示，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠卵巢卵泡數(shù)量少，未見(jiàn)明顯成熟卵泡，閉鎖卵泡多，黃體數(shù)量少，體積小。陰道涂片觀察可見(jiàn)大鼠沒(méi)有穩(wěn)定的動(dòng)情周期變化。調(diào)經(jīng)湯組大鼠成熟卵泡數(shù)量明顯增加，卵泡液含量也有所增多，黃體數(shù)目明顯增多，體積也明顯變大，子宮內(nèi)膜也有所增厚。陰道涂片分析可見(jiàn)大鼠的動(dòng)情周期變化逐漸恢復(fù)穩(wěn)定。說(shuō)明調(diào)經(jīng)湯對(duì)順鉑致卵巢早熟模型大鼠的治療效果優(yōu)于雌二醇。

表1 各組大鼠治療后血清性激素含量比較（±s）

表1 各組大鼠治療后血清性激素含量比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；FSH：促卵泡生成素；E2：雌激素；LH：促黃體生成素

?

本研究顯示，利用順鉑建立雌性大鼠卵巢早衰動(dòng)物模型，成功損傷卵巢功能，影響卵泡的正常生長(zhǎng)發(fā)育及排卵過(guò)程，導(dǎo)致卵泡丟失、閉鎖、不排卵，調(diào)經(jīng)湯對(duì)卵巢早衰模型大鼠修復(fù)卵巢功能具有較高的療效。

［1］李茜西，呂德欣.卵巢早衰的病因及治療研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（30）：164-168.

［2］豐有吉，沈慳.婦產(chǎn)科學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：252.

［3］徐苓，宋亦軍.卵巢早衰的臨床表現(xiàn)和診斷標(biāo)準(zhǔn)［J］.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2003，19（4）：195-196.

［4］張麗娟，陶仕英，趙丕文，等.順鉑建立大鼠卵巢模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.世界中醫(yī)藥，2015，10（10）：1563-1569.

［5］方溪.17β-雌二醇對(duì)動(dòng)情后期大鼠的離體垂體小片進(jìn)行表面灌流其促性腺激素分泌有急性抑制性影響［J］.國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，1991，5（5）：92-98.

Effect of Tiaojing Decoction on Treatment of Premature Ovarian Failure in Rats

SHEN Wei1,CHEN Xueqi2.
1 Drug Preparation Center,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China.2 Department of Gynecology，the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of Tiaojing decoction on treatment of premature ovarian failure in rats.MethodsSixty female adult rats were randomly divided into blank group,model group,positive drug control group,andlow-,medium-,and high-dose of Tiaojing decoction groups,with 10 rats in each group.Premature ovarian failure rat model was established through 7-consecutive-day intraperitoneal injection of cisplatin solution in all groups except for blank group.The oestrous cycle was observed,the variation in content of FSH,E2,LH was detected with radioimmunoassay and ovarian pathological changes were observed under light microscope in all group.ResultsThe model group and positive drug control had no stable estrous cycle while high-dose and medium dose Tiaojing decoction group gradually restored the estrous cycle.On day 7 and 14,the serum FSH（Day7:7.38±0.99IU/L,Day 14:8.01±0.13IU/L）and LH（Day 7:3.35±0.27）ng/L,Day 14:4.22±0.82ng/L）increased and E2（Day 7:94.04±6.22ng/L,Day 14:131.74±23.65ng/L）decreased compared with those in blank group（FSH:Day 7:6.18±0.24IU/L,Day 14:6.97±0.88IU/L;LH:Day 7:2.79±0.24ng/L,Day 14:3.20±0.17ng/L;E2:Day 7:109.10±5.69ng/L,Day 14:157.82±5.68ng/L）,all withP＜0.05;on day 7,compared with those in the model group,the serum FSH content decreased and E2 content increased in the low-,middle-and high-dose Tiaojing decoction groups（FSH:5.72±0.51IU/L,6.20±1.05IU/L,6.08±0.26IU/L;E2:104.46±10.25ng/L,104.48±12.85ng/L,106.64±8.67ng/L,allP＜0.05）,but the serum LH level decreased without significant difference（2.96±0.38ng/L,3.00±0.19ng/L,2.96±0.23ng/L,P＞0.05）;on day 14,the FSH（7.02±1.04IU/L）and LH（3.37±0.53ng/L）in the middledose of Tiaojing decoction group were lower and E2（153.67±20.55ng/L）was higher than those in the model group（P＜0.05）.Ovarian tissue pathological changes such as ovarian volume contraction,less follicular growth,increase in atresia follicles,partly replaced by fibrous tissue,less corpus luteum in number,and thinner endometrium were observed in the model group.These pathological changes were improved in Tiaojing decoction groups,such as more follicular growth,increase in corpus luteum number,and thicker endometrium.ConclusionTiaojing decoction can improve the ovarian function of rats with premature ovarian failure induced by cisplatin.

rats;premature ovarian failure;Tiaojing decoction;cisplatin

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃（No.2014ZA047）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃（2015ZA114）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃（No.2016ZA112）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃（No.2017ZZ009）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑中心（杭州310006）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦科（杭州310006）

陳學(xué)奇，Tel：057187071760；E-mail：1810633261@qq.com

（收稿：2017-06-06修回：2017-07-14）