董彬+封麗霞+馮曉+王紅坤+李春梅

摘 要：食源性致病菌污染是乳制品安全問題的重要隱患之一，乳品中常見的食源性致病菌有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌等。目前，乳品中致病菌的檢測(cè)以培養(yǎng)法為主，但此類方法操作較為繁瑣，且耗時(shí)長(zhǎng)，不能滿足檢測(cè)的時(shí)效需求。本文探索了熒光定量PCR技術(shù)在快速檢測(cè)乳品中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的應(yīng)用，并進(jìn)行了大量的驗(yàn)證試驗(yàn)和實(shí)際檢測(cè)，形成了乳品中致病菌快速檢測(cè)的新體系。該體系可以在24h內(nèi)完成金黃色葡萄菌和沙門氏菌的增菌與檢測(cè)，縮短了整體檢測(cè)時(shí)間，降低了檢測(cè)成本，為進(jìn)一步改良乳品中致病菌快速檢測(cè)提供了參考數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：乳品 金黃色葡萄菌 沙門氏菌 熒光定量PCR 檢測(cè)

在食品安全問題日益多元化的今天，在食品中占特殊地位的乳及乳制品的安全性一直是社會(huì)和科學(xué)研究關(guān)注的焦點(diǎn)。乳制品營(yíng)養(yǎng)豐富、搭配均衡，是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的優(yōu)質(zhì)蛋白。我國(guó)是乳制品消費(fèi)大國(guó)，也是世界第三大乳制品生產(chǎn)國(guó)。國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，[1]我國(guó)城鎮(zhèn)居民家庭鮮奶人均購(gòu)買量由1996年的4.6kg上升到2006年的18.3kg，雖從2007年開始有所下降，但一直維持在14kg左右。然而，近年來頻繁發(fā)生的乳與乳制品質(zhì)量安全事件引起了人們對(duì)乳制品安全的普遍關(guān)注。乳品極易遭受致病菌污染，常見的污染乳制品的食源性致病菌有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌等，其進(jìn)入人體后會(huì)造成腹瀉、嘔吐、急性腸胃炎等病癥，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及生命。其中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌是乳品檢測(cè)最普遍的項(xiàng)目。

金黃色葡萄球菌腸毒素是世界性衛(wèi)生問題，乳品尤其是原料乳極易受到金黃色葡萄球菌的污染。2009年歐洲食品安全局報(bào)道了5550例食物中毒事件，導(dǎo)致49000人患病、46人死亡，其中293例由金黃色葡萄球菌感染引起，由此可見金黃色葡萄球菌的危害極大。是歐洲最常見的4種引發(fā)食物中毒的病原菌之一[2]，生乳及乳制品污染中比較常見的另一種食源性致病菌是沙門氏菌（Salmonella spp.），受其感染的人和動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)傷寒、副傷寒等病癥，沙門氏菌一旦進(jìn)入血液組織，則會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥，甚至死亡。1994年美國(guó)暴發(fā)了由沙門氏菌導(dǎo)致的冰淇淋污染，導(dǎo)致約22400人患病[3]。

一個(gè)中等規(guī)模的乳品工廠，一天生產(chǎn)的不同類產(chǎn)品至少有上百個(gè)批次，加工過程中的原料、過程品、終產(chǎn)品、生產(chǎn)環(huán)境都需要檢測(cè)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。GB 4789.1-2016規(guī)定同一批次產(chǎn)品需采集5個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，故工廠的檢測(cè)量每天高達(dá)幾百個(gè)。根據(jù)GB 4789.4-2016和GB 4789.10-2016，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的定性判定至少需要3d，該方法操作較繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，不能滿足檢測(cè)的時(shí)效需求。由于低溫奶保質(zhì)期較短，我國(guó)正在推動(dòng)的國(guó)家優(yōu)質(zhì)乳工程，在對(duì)產(chǎn)品要求提高的同時(shí)也對(duì)檢測(cè)技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。

本文提出的創(chuàng)新檢測(cè)體系優(yōu)化了樣品前處理過程，并引入了熒光定量PCR分子檢測(cè)技術(shù)，可以在24h內(nèi)完成金黃色葡萄菌和沙門氏菌的增菌和檢測(cè)。在進(jìn)行了大量驗(yàn)證試驗(yàn)和實(shí)際檢測(cè)后，結(jié)果表明此檢測(cè)體系穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確性高，縮短了整體檢測(cè)時(shí)間，并降低了檢測(cè)成本，為乳品致病菌檢測(cè)技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展提供了研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)思路

常見致病菌qPCR的檢測(cè)限一般在103CFU/mL以下[4～6]，而增菌后濃度一般可達(dá)105CFU/mL以上，增菌后多個(gè)樣本增菌液混合提取核酸處理檢測(cè)相當(dāng)于稀釋多倍（5個(gè)樣本增菌液混合相當(dāng)于稀釋5倍），一般會(huì)高于檢測(cè)限，從理論上來講，采用五合一PCR檢測(cè)能夠滿足國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)的需求。

2 實(shí)驗(yàn)材料

2.1 樣本

樣品取自光明乳業(yè)華東中心工廠生產(chǎn)線，主要為發(fā)酵乳（包括風(fēng)味發(fā)酵乳、果味發(fā)酵乳、暢優(yōu)發(fā)酵乳、健能發(fā)酵乳、大果粒發(fā)酵乳和莫斯利安發(fā)酵乳）和部分鮮奶制品（包括無乳糖牛奶、優(yōu)倍牛奶、純牛奶與致優(yōu)全鮮乳）。

2.2 菌株

金黃色葡萄球菌陽性菌株：ATCC27217；沙門氏菌陽性菌株：CMCC50333。

2.3 主要試劑

金黃色葡萄球菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-探針法）LR70501、沙門氏菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-探針法）LR70601，購(gòu)自北京良潤(rùn)生物科技有限公司。

2.4 主要儀器

實(shí)時(shí)熒光PCR儀：雅睿MA-6000P；恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)（2mL、5mL、7mL）、掌式離心機(jī)（0.2mL 8聯(lián)管）、金屬浴、渦旋混合器、移液器（10μL、100μL、1000μL）及吸頭、離心管（2mL、5mL、7mL）、PCR反應(yīng)管（0.2mL）等。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

同一樣品的5次采樣為1組，其中取1～5次進(jìn)行金黃色葡萄球菌/沙門氏菌添加（101 CFU），使用國(guó)標(biāo)增菌培養(yǎng)基增菌后，分別取1mL混合后進(jìn)行基因組提取，5次采樣的增菌培養(yǎng)基按照國(guó)標(biāo)方法繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)鑒定，并記錄鑒定結(jié)果（共30組，只記錄組檢測(cè)結(jié)果）。

3.2 樣本實(shí)驗(yàn)

在工廠進(jìn)行實(shí)際樣本（發(fā)酵乳及部分其他鮮奶制品）的檢測(cè)，采用五合一PCR方法（同時(shí)以國(guó)標(biāo)方法來做對(duì)比）記錄每組檢測(cè)結(jié)果，共1596組發(fā)酵乳、912組鮮奶制品。在前兩周的檢測(cè)中，每天從樣品中取兩組，從中各取一份樣品進(jìn)行陽性添加并記錄檢測(cè)結(jié)果（共30組）。

4 結(jié)果與分析

4.1 驗(yàn)證結(jié)果分析

金黃色葡萄球菌五合一PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五合一 PCR檢測(cè)與普通國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果沒有顯著性差異，不會(huì)出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，如表1。

注：*1表示該樣品的5次采樣中取n次做陽性添加；*2表示1個(gè)樣品的5次采樣按照國(guó)標(biāo)法檢測(cè)，有一次為陽性該樣品即為陽性；*3表示1個(gè)樣品的5次采樣增菌后各取1mL混勻后進(jìn)行基因組提取檢測(cè)，結(jié)果即為樣品結(jié)果。

沙門氏菌五合一PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該檢測(cè)與普通國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果沒有顯著性差異，不會(huì)出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，如表2。

注：*1表示該樣品的5次采樣中取n次做陽性添加；*2表示1個(gè)樣品的5次采樣按照國(guó)標(biāo)法檢測(cè)，有一次為陽性該樣品即為陽性；*3表示1個(gè)樣品的5次采樣增菌后各取1mL混勻后進(jìn)行基因組提取檢測(cè)，結(jié)果即為樣品結(jié)果。

4.2 樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

在1596組發(fā)酵乳及912組鮮奶制品的金黃色葡萄球菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，五合一PCR檢測(cè)與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果沒有顯著性差異（國(guó)標(biāo)法發(fā)酵乳金黃色葡萄球菌檢測(cè)有55組疑似陽性，但后續(xù)驗(yàn)證結(jié)果為金黃色葡萄球菌陰性；共30組樣品的陽性添加用兩種方法檢測(cè)都為陽性），如表3所示。

在1596組發(fā)酵乳及912組鮮奶制品的沙門氏菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，五合一PCR檢測(cè)與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果沒有顯著性差異（國(guó)標(biāo)法沙門氏菌檢測(cè)有38組疑似陽性，但后續(xù)驗(yàn)證結(jié)果為沙門氏菌陰性；共30組樣品的陽性添加用兩種方法檢測(cè)都為陽性），如表4所示。

5 結(jié)論與展望

5.1 結(jié)論

本文探索了一種乳品中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌快速檢測(cè)體系，采用Real-Time PCR方法，對(duì)一組樣本5次采樣的前增菌液混合后進(jìn)行基因組提取，使用金黃色葡萄球菌和沙門氏菌核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，極大的縮短了檢測(cè)時(shí)間，減小了工作強(qiáng)度。

經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以及實(shí)際樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，五合一PCR檢測(cè)與常規(guī)國(guó)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果并沒有顯著差異，不會(huì)造成漏檢。

通過對(duì)1596組發(fā)酵乳及912組鮮奶制品的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)，在檢測(cè)發(fā)酵乳與鮮奶制品時(shí)，五合一PCR檢測(cè)與常規(guī)國(guó)標(biāo)檢測(cè)相比耗時(shí)更少，準(zhǔn)確度更好，工作強(qiáng)度更低。

5.2 展望

目前，有研究人員探索了食品中多種致病菌的同步增菌[7]技術(shù)，未來有希望由一種培養(yǎng)基來實(shí)現(xiàn)多種致病菌的同步增菌，而多重PCR也可實(shí)現(xiàn)多種致病菌的同時(shí)檢測(cè)，技術(shù)的發(fā)展將會(huì)使致病菌的檢測(cè)更加便捷。

近年來，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）已將PCR方法制定為檢測(cè)食源性致病菌的標(biāo)準(zhǔn)化方法[8]。不久的將來，熒光定量PCR有望在沙門氏菌及其他致病菌快速檢測(cè)上實(shí)現(xiàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)化。建議食品檢驗(yàn)方法應(yīng)剝離于安全標(biāo)準(zhǔn)之外（即非強(qiáng)制性），給予檢測(cè)者選擇使用快速檢驗(yàn)方法的合理空間。

隨著乳制品質(zhì)量要求和營(yíng)養(yǎng)要求的不斷提高，對(duì)相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)也提出了更高的要求。隨著科技的不斷發(fā)展，乳制品中致病菌的檢測(cè)靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性、便捷性和及時(shí)性等方面都將得到不斷的發(fā)展和改善。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張亞紅，王娉.預(yù)測(cè)微生物學(xué)在乳及乳制品中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2015，25（6）：62-65.

[2] European Food Safety Authority.The European Union summary report on trends and sources of Zoonoses，Zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2009[J].EFSA Journal，2011，9（3）：2090.

[3] 鄢雷娜等.乳制品中常見食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2017，8（1）：137-141.

[4] 佘容等.TaqMan熒光定量PCR在飼料沙門氏菌檢測(cè)中的應(yīng)用評(píng)估[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，37（12）.

[5] 蘇裕心等.熒光定量PCR快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌方法的建立[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2010，34（1）.

[6] 張馳等.食品中3種致病菌的Taqman多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)[J].食品研究與開發(fā)，2011，32（4）.

[7] 張巧艷等.乳制品常見致病菌選擇性共增菌技術(shù)研究[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2011，39（5）.

[8] Malorny B，Made D，Teufel P，et al. Multicenter validation study of two blockcycler-and one capillarybased real-time PCR methods for the detection of Salmonella in milk powder[J]. International Journal of Food Microbiology，2007，117：211-218.