不同產(chǎn)地山豆根UPLC指紋圖譜的研究

程錢 趙崇軍 代一航 汪建芬 夏青 張文婷 王金鳳 馬志強(qiáng) 林瑞超

山豆根為豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的干燥根和根莖，而北豆根為防己科植物蝙蝠葛MertispermumdauricumDC.的干燥根莖[1]。山豆根主要分布于廣西百色、東蘭縣、金城江、云南等地，北豆根則主要分布在北方，湖北亦有[2]。兩者皆性寒味苦，有清熱解毒，消腫利咽之功效，但山豆根毒性比北豆根較強(qiáng)[3]。因山豆根與北豆根有相似的功效，植物形態(tài)相似，所以在民間常把兩者混用，因此中毒事件也是屢見報道[4]。李妃等[5]對山豆根的化學(xué)成分、藥理作用、毒理作用以及毒性成分檢測等內(nèi)容進(jìn)行了較為詳細(xì)的總結(jié)和討論。超高效液相色譜法(ultra-high performance liquid chromatography，UPLC)是近些年新型的色譜分離分析技術(shù)，采用了更為細(xì)小的1.8 μm填料的色譜柱，相對于傳統(tǒng)的HPLC，有更好的分離效率及靈敏度[6]，本文采用UPLC對不同產(chǎn)地山豆根進(jìn)行指紋圖譜研究，為綜合評價和控制山豆根的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)，也為區(qū)分山豆根與北豆根提供了研究思路。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters H-Class超高效液相色譜儀(美國Waters科技有限公司)，98-1-B型電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)，NewClassic MF電子分析天平(Mettler Toledo)。

1.2 藥材樣品

實(shí)驗(yàn)所用的山豆根及北豆根藥材樣品從廣西、云南、湖北等地采集，見表1。樣品經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定系王晶娟副教授鑒定為山豆根SophoratonkinensisGagnep.?？鄥A和氧化苦參堿對照品(均由成都普思生物科技有限公司提供，批號分別為PS0187-0010、 PS0187-020，純度均≥98%)；乙腈為色譜純，水為去離子水，其他試劑均為分析純。

表1 山豆根及北豆根產(chǎn)地及采摘日期

1.3 色譜條件

Agilent Zorbax SB C-18 RRHD色譜柱(2.1×100 mm，1.8 μm)，流速0.3 mL/min，檢測波長215 nm，柱溫30℃，理論板數(shù)以氧化苦參堿計(jì)不低于4000，流動相乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)進(jìn)行梯度洗脫(0～5分鐘，5%A；5～6分鐘，5%～9%A；6～6.5分鐘，9%～12%A；6.5～11分鐘，12%～15%A；11～21分鐘，15%～34%A；21～23分鐘，34%～45%A；23～26分鐘，45%～47%A；26～27分鐘，47%～77%A；27～35分鐘，77%～98%A)。

1.4 供試品溶液的制備

精密稱定山豆根粉末2.5 g，置圓底燒瓶中，加入無水乙醇-氨水(3∶2)1 mL[7]，放置0.5小時后加入70%甲醇25 mL，在電熱套上加熱回流2小時，冷卻，濾過，回收溶劑，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

1.5 對照品溶液的配制

分別取苦參堿和氧化苦參堿對照品約6 mg、10 mg，精密稱定，分別置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 精密度試驗(yàn) 精密稱定S1號山豆根藥材粉末2.5 g，按1.4項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按1.3項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定，結(jié)果顯示，各色譜峰相對保留時間RSD 0.05%～0.3%；各色譜峰相對峰面積RSD 0.5%～3.6%，表明儀器精密度良好。

1.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定S1號山豆根藥材粉末6份，每份2.5 g，按1.4項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按1.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，6份樣品的各色譜峰相對保留時間RSD 0.02%～0.15%；各色譜峰相對峰面積 RSD 1.8%～3.9%，表明樣品重復(fù)性良好。

1.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的一供試品溶液，按1.3項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24小時進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，各色譜峰相對保留時間RSD 0.05%～0.4%,各色譜峰相對峰面積RSD 0.6%～4.1%,表明供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 各個批次指紋圖譜的采集

精密稱定各個批次山豆根藥材粉末2.5 g，按照1.4項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并按照1.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，記錄10批次山豆根的色譜圖，以《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》建立山豆根藥材UPLC指紋圖譜。

2.2 參照色譜峰的建立

本實(shí)驗(yàn)中的苦參堿和氧化苦參堿為山豆根中的共有成分，含量較高，且氧化苦參堿的保留時間比苦參堿稍長，故選用氧化苦參堿(7號峰)為參照峰，見圖1。

注：5：苦參堿；7：氧化苦參堿。

2.3 共有峰的確定

運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》對各批次色譜圖進(jìn)行分析，各個批次都具有的色譜峰標(biāo)定為共有色譜峰。本文共標(biāo)定29個共有峰，見圖2。相似度軟件設(shè)置，選擇S1號山豆根藥材的色譜圖為參照圖譜，以中位數(shù)法作為生成對照指紋圖譜的方法，設(shè)定時間窗寬度為0.2分鐘，軟件自動進(jìn)行多點(diǎn)校正，全峰匹配，系統(tǒng)根據(jù)各個批次樣品色譜圖的共有模式生成對照指紋圖譜作為山豆根的指紋圖譜。以參照峰的保留時間和峰面積為基準(zhǔn)1，分別計(jì)算10批山豆根藥材共有峰的相對保留時間和相對峰面積，見表2、3。結(jié)果表明不同批次山豆根藥材共有峰相對保留時間RSD 3.925%～4.588%，而相對峰面積的RSD 較大。由此可知，不同批次山豆根具有相似的成分，但是不同批次相似成分的含量卻相差較大。

2.4 共有峰的指認(rèn)

利用對照品對照法對共有峰進(jìn)行指認(rèn)，取苦參堿、氧化苦參堿適量配成對照品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，得到5號峰、7號峰兩個色譜峰和對照品的保留時間一致，并且通過PDA檢測器紫外吸收光譜進(jìn)行對比，結(jié)果均一致，因此確定5號峰為苦參堿，7號峰為氧化苦參堿。

2.5 山豆根相似度評價

本實(shí)驗(yàn)采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》對10批山豆根藥材UPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算，見表4。

3 討論

提取方法的選擇：本文在綜合參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]的基礎(chǔ)上, 結(jié)合藥材的化學(xué)成分屬性和提取效率等因素，考察了不同的提取方法，結(jié)果顯示，加入無水乙醇-氨水(3∶2)適量0.5小時后，以十倍藥材量70%甲醇提取2小時，提取效果較好，供試品色譜峰較多，可更大程度地反應(yīng)藥材的特征信息。

檢測波長的選擇：本文選用了Waters超高效液相色譜二極管陣列檢測器，對樣品進(jìn)行了全波長的掃描，在遵循信息最大量的原則下，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，215 nm時，色譜圖峰數(shù)量豐富、分離度較好，基線平穩(wěn)。因此以215 nm作為檢測波長。

圖2 S1號山豆根藥材色譜圖

表2 10批山豆根藥材樣品共有峰相對保留時間

表3 10批山豆根樣品共有峰相對峰面積

表4 山豆根藥材UPLC指紋圖譜相似度計(jì)算

注： SR—由軟件生成的對照指紋圖譜。

圖3 共有模式建立對照指紋圖譜

圖4 10批山豆根(S1-S10)和2批北豆根(S11-S12)UPLC疊加色譜

實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新之處：本文運(yùn)用了目前分離效率和效果較高的超高效液相色譜技術(shù)，與傳統(tǒng)的高效液相色譜比較，其在分離效率和分析能力上均有較大的進(jìn)步，為首次使用UPLC對不同產(chǎn)地的山豆根指紋圖譜進(jìn)行了研究。同時，該研究對于中藥材等復(fù)雜樣品的成分分析與質(zhì)量控制，具有很好的適用性和優(yōu)勢。同時本文從色譜指紋圖譜的角度為分析山豆根與北豆根區(qū)別提供了思路，有一定實(shí)用價值。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2005.

[2] 李可強(qiáng),劉威,張振秋. HPLC法測定北豆根藥材中粉防己堿和青藤堿[J]. 中草藥,2008,39(4):607-609.

[3] 周友紅,呼海濤.山豆根不可與北豆根混用[J].中國民族民間醫(yī)藥,2008,17(2):55-56.

[4] 孫蓉,王晨.北豆根毒性研究進(jìn)展[J].中國藥物警戒,2009,6(9):546-549.

[5] 李妃,李成平,付暉,等.山豆根研究進(jìn)展及毒性成分檢測方法補(bǔ)充報道[J].藥物分析,2013,33(8):1453-1463.

[6] 劉芷,賈英,趙旭,等. 五味子的UPLC指紋圖譜研究[J].中草藥,2014, 45(11):1631-1633.

[7] 劉吉成,盧森華,謝巍,等. 廣西多葉越南槐HPLC指紋圖譜的建立及與山豆根HPLC指紋圖譜一致性比較研究[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014,20(23):89-94.

[8] 黃亞非,黃際薇,陶玲,等. 廣西不同產(chǎn)地山豆根的指紋圖譜特征研究[J]. 中藥材,2005,28(1) :21.

[9] 黃穎,王乃平,陳勇. 廣西產(chǎn)山豆根HPLC指紋圖譜測定[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(14):66.