祝行琴

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310008）

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其在我國(guó)的發(fā)病率正逐年攀升，尤其在東南沿海等發(fā)達(dá)地區(qū)[1]。而結(jié)直腸腺癌是由結(jié)直腸腺瘤逐步發(fā)展而來，因此，通過研究結(jié)直腸腺瘤的發(fā)病機(jī)制能夠進(jìn)一步揭示結(jié)直腸腺癌的起源。維生素D廣為人知的功能是其調(diào)節(jié)小腸、骨骼和腎臟對(duì)鈣離子的吸收及代謝。近年來，有研究者認(rèn)為維生素D與結(jié)直腸癌有著密不可分的聯(lián)系[2]?；谝陨涎芯楷F(xiàn)狀，本研究旨在探討維生素D及其受體與結(jié)直腸癌癌前病變——結(jié)直腸腺瘤的相關(guān)性。

1.資料與方法

1.1 一般資料

2016—2017年期間收集本院被確診為結(jié)直腸腺瘤患者病例45例，其中男性22例，女性23例，年齡36～72歲，獲取其全血標(biāo)本及組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)確診的結(jié)直腸腺瘤患者，具有完整臨床和病理資料；無免疫相關(guān)疾病或其他原發(fā)腫瘤病史。以同時(shí)期本院健康查體人群30例作為正常對(duì)照組，排除自身免疫相關(guān)疾病及長(zhǎng)期服用激素者。

1.2 ELISA技術(shù)測(cè)定血漿維生素D濃度

收集全血標(biāo)本，離心并取上清，于-80℃長(zhǎng)期保存。采用25羥基總維生素D定量測(cè)定試劑盒(LIAISON 25-OH Vitamin D TOTAL Assay，DiaSorin Inc.USA)，利用LIAISON化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)，試劑盒檢測(cè)范圍為4.0～150ng/mL。

1.3 RNA的提取

收集組織用液氮冷凍后于存-80℃長(zhǎng)期保存。組織加入Trizol試劑后進(jìn)行勻漿處理，將組織充分裂解。隨后加入氯仿200μL，劇烈震蕩15s，12000g離心15min，將上清液移至另一離心管中，加入等體積異丙醇冰上沉淀，75%乙醇洗滌、空氣干燥后，以適量DEPC水溶解并檢測(cè)RNA的純度及濃度。

1.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)

取上述提取的RNA為模板，首先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。VDR引物上游：CTGACCCTGGAGACTTTGAC，下游：TTCCTCTGCACTTCCTCATC。反應(yīng)條件：變性95℃ 5s、退火55℃ 15s、延伸72℃ 20s，40個(gè)循環(huán)。以2-△△Ct法分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布資料以均數(shù)±方差描述，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)資料以中位數(shù)(IQR)表示，兩組比較采用Mann-whitney U檢驗(yàn)分析。

2.結(jié)果

2.1 維生素D在結(jié)直腸腺瘤患者中低表達(dá)

經(jīng)檢測(cè)，正常組血漿中25-OH-D的濃度（41.35ng/ml±4.570ng/ml）明顯高于結(jié)直腸腺瘤組（22.28ng/ml±2.445ng/ml，P＜0.01）；同時(shí)，我們將腺瘤組的血漿維生素D濃度與患者的年齡、性別、吸煙、飲酒、腫瘤的部位、大小、病理類型等進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)均無相關(guān)性。而將維生素D缺乏作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析，其腺瘤組表現(xiàn)為（OR：4.875；95%CI：2.144～11.084）。

2.2 維生素D受體在結(jié)直腸腺瘤患者中低表達(dá)

以正常組的組織作為參照，正常組織VDRmRNA的表達(dá)水平（1.00±0.22）明顯高于腺瘤組織（0.52±0.08，P＜0.01），但結(jié)直腸腺瘤組織中VDRmRNA的表達(dá)與患者的年齡、性別、吸煙、飲酒、腫瘤大小、病理類型等的關(guān)系，我們未發(fā)現(xiàn)其相關(guān)性。

3.討論

有文獻(xiàn)報(bào)道稱維生素D缺乏是結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)因素，研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)血中25-(OH)D的水平與大腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[3]。而本研究中兩組血漿維生素D比較來看，正常組明顯高于腺瘤組（P＜0.01），將維生素D缺乏作為危險(xiǎn)因素計(jì)算出腺瘤組（OR：4.875；95%CI：2.144～11.084），研究結(jié)果進(jìn)一步說明維生素D在腺瘤形成的時(shí)期便開始減少，并貫穿從腺瘤到腺癌的過程，可以作為結(jié)直腸腺瘤的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而維生素D發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要條件之一便是與維生素D受體相結(jié)合。有研究證實(shí)，維生素D能在結(jié)腸腺癌細(xì)胞中與維生素D受體結(jié)合，從而通過調(diào)節(jié)下游靶基因如MYC、EGFR等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖[4]。因此，若缺乏維生素D受體，則即使補(bǔ)充維生素D也無法發(fā)揮抗腫瘤的作用。結(jié)合本研究中的發(fā)現(xiàn)，腺瘤組織中的維生素D受體表達(dá)顯著降低（P＜0.01），這說明維生素D受體表達(dá)水平的降低從結(jié)直腸腺瘤階段已經(jīng)發(fā)生了，并貫穿結(jié)直腸癌癌變的過程。在結(jié)直腸腺瘤患者中維生素D受體表達(dá)的底下以及血漿維生素D水平的降低共同影響促進(jìn)了腺瘤的發(fā)生發(fā)展并進(jìn)一步促進(jìn)腺瘤向腺癌發(fā)展的進(jìn)程。

綜上所述，血漿維生素D可作為結(jié)直腸腺瘤的危險(xiǎn)因素，維生素D或可作為預(yù)防結(jié)直腸腺瘤的藥物，但由于服用高劑量的維生素D存在高鈣血癥的風(fēng)險(xiǎn)，因此在注重提高維生素D攝入量的同時(shí)再提高維生素D受體的水平使之能更好地結(jié)合共同發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)也能不引起高鈣血癥。另一方面，由于維生素D缺乏在正常人群中也普遍存在[5]，將維生素D作為結(jié)直腸腺瘤的診斷標(biāo)志物并不合適。

[1]代珍,鄭榮壽,鄒小農(nóng)，等.中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病趨勢(shì)分析和預(yù)測(cè)[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 46(7): 598-603.

[2] Ranji P,Akbarzadeh A,Rahmati-Yamchi M.Associations of Probiotics with Vitamin D and Leptin Receptors and their Effects on Colon Cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev.2015;16(9):3621-7.

[3] Jenab M,Bueno-de-Mesquita HB,Ferrari P,et al.Association between pre-diagnostic circulating vitamin Dconcentration and risk of colorectal cancer in European populations:a nested case-control study[J]. BMJ. 2010,340:b5500.

[4]方瑩,宋皓軍,丁小云. 維生素D抗結(jié)直腸癌的研究進(jìn)展[J].腫瘤, 2014; 11:1064.

[5] Khadilkar VV,Khadilkar AV.Use of Vitamin D in Various Disorders[J]. Indian J Pediatr.2013;80(3):215-8.