（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 廣東 廣州 510515）

孫雅玲 陳龍華(通訊作者)

1.背景介紹

腎細(xì)胞癌簡(jiǎn)稱腎癌，起源于腎小管上皮細(xì)胞，是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其中腎透明細(xì)胞癌為最主要的類型，約占腎細(xì)胞癌的75%[1]。腎透明細(xì)胞癌起病隱匿，約30%患者診斷時(shí)已為晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，而腎透明細(xì)胞癌對(duì)于放療及化療均不敏感。目前臨床應(yīng)用中尚無(wú)可靠的診斷標(biāo)記物，因此檢測(cè)腎細(xì)胞癌差異表達(dá)基因，尋找分子診斷標(biāo)記物及潛在臨床治療靶點(diǎn)具有重要意義。

腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因多步驟的過(guò)程，而高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及基因芯片的出現(xiàn)為研究腎透明細(xì)胞癌基因表達(dá)譜情況提供了基礎(chǔ)。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的腎透明細(xì)胞癌基因芯片進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期獲取腎透明細(xì)胞癌相關(guān)的關(guān)鍵基因，為后續(xù)尋找分子標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

2.材料和方法

2.1 芯片數(shù)據(jù)獲取

從GEO中下載腎透明細(xì)胞癌基因表達(dá)譜芯片GSE46699，該芯片基于GPL571 平臺(tái)（[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array），共有130例腎透明細(xì)胞癌及正常腎組織樣本，本研究選取其中32例非吸煙非肥胖腎透明細(xì)胞癌患者樣本和28例非吸煙非肥胖正常對(duì)照樣本進(jìn)行分析。

2.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理與差異表達(dá)基因分析

數(shù)據(jù)處理和分析使用R軟件進(jìn)行。對(duì)原始表達(dá)數(shù)據(jù)使用RMA算法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用“Limma”包篩選在腎透明細(xì)胞癌及正常腎組織中差異表達(dá)的基因，差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：校正后P值(adjustP-value) ＜ 0.05，|logFC|＞ 1。

2.3 GO和KEGG分析

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因在GO中注釋其參與的生物學(xué)過(guò)程，并進(jìn)行KEGG通路富集分析。以P＜0.05作為顯著性閾值。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及樞紐基因篩選

使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因?qū)?yīng)蛋白質(zhì)進(jìn)行相互作用關(guān)系分析，以此構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖并用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，通過(guò)計(jì)算單個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)間的關(guān)系強(qiáng)度來(lái)篩選排名前20的樞紐基因。

3.結(jié)果

3.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

在GSE46699芯片中根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)共得到848個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因有384個(gè)，下調(diào)基因有464個(gè)，差異表達(dá)基因熱圖見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因熱圖

3.2 GO功能富集分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)848個(gè)差異基因所參與的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行分析，結(jié)果顯示差異基因主要涉及免疫反應(yīng)、防御反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、血管形成等過(guò)程（圖2）。

圖2 差異表達(dá)基因功能富集分析

3.3 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果顯示差異基因主要集中在細(xì)胞黏附分子、氨基酸代謝降解、PPAR信號(hào)通路等通路中（圖3）。

圖3 差異表達(dá)基因KEGG通路分析

3.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和樞紐基因

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因?qū)?yīng)蛋白產(chǎn)物的相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，并應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖4）。進(jìn)一步計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)相關(guān)的數(shù)目并由高到低進(jìn)行排序，獲得排名前20的樞紐基因，包括COL1A1、COL1A2、COL6A2、COL6A3、COL4A2、COL4A4、COL4A5、COL4A3、COL3A1、COL5A2、COL5A1、COL8A1、COL15A1、COL23A1、COL21A1、DCN、FN1、CCL5、CXCR4、CXCL9。

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

4.討論

腎透明細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，約占實(shí)體瘤的3%，它具有發(fā)展快，易轉(zhuǎn)移，易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，且對(duì)放化療及內(nèi)分泌治療均不敏感。腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與，涉及多個(gè)步驟的過(guò)程，目前其具體的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。為進(jìn)一步了解腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，篩選可作為臨床診斷的關(guān)鍵基因和潛在治療靶點(diǎn)，本研究以腎透明細(xì)胞癌為研究對(duì)象，通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)芯片GSE46699進(jìn)行分析，篩選差異表達(dá)基因并對(duì)差異基因進(jìn)行功能注釋、通路分析和對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系分析。

通過(guò)將腎透明細(xì)胞癌組織測(cè)序信息和正常組織測(cè)序信息進(jìn)行比較，共篩選出848個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括384個(gè)上調(diào)基因，464個(gè)下調(diào)基因。使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行分析，構(gòu)建出了以COL1A1、COL1A2、COL6A2、COL6A3、COL4A2、COL4A4、COL4A5、COL4A3、COL3A1、COL5A2、COL5A1、COL8A1、COL15A1、COL23A1、COL21A1、DCN、FN1、CCL5、CXCR4、CXCL9等為中心節(jié)點(diǎn)形成的蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)。對(duì)以上樞紐基因進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)其中一些基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。COL1A1、COL1A2基因分別編碼I型膠原纖維的α1鏈和α2鏈，而I型膠原纖維參與形成細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)于細(xì)胞的粘附及分化有重要作用，此外，COL5A1、COL8A1、FN1等也均為細(xì)胞粘附相關(guān)基因。和正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞間的粘附作用普遍降低，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移。在腎透明細(xì)胞癌中，研究發(fā)現(xiàn)COL1A1、COL5A1、COL8A1、FN1表達(dá)升高且與患者的不良預(yù)后相關(guān)，在腎癌細(xì)胞株Caki-2中，外源性補(bǔ)充TGF-β1可上調(diào)COL1A1、COL5A1、COL8A1、FN1的表達(dá)[2]。因此，細(xì)胞粘附性的改變可能在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

在這20個(gè)樞紐基因中，CCL5、CXCR4、CXCL9與炎癥及免疫密切相關(guān)，其中CCL5是CC趨化因子亞家族成員，CXCL9是CXC趨化因子亞家族成員，CXCR4是CXC趨化因子受體之一。炎癥及免疫反應(yīng)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，其中，CXC趨化因子配體及其受體被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)血管生成，影響腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞間的相互作用。在腎癌中，多種趨化因子配體及其受體的表達(dá)水平均發(fā)生了改變，且與腫瘤分期及患者預(yù)后顯著相關(guān)，有可能成為新型診斷及預(yù)后分子標(biāo)志物[3]，其中CXCR4的高表達(dá)被證實(shí)是腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其結(jié)合TNM分期構(gòu)建的列線圖預(yù)測(cè)模型可以更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者的總生存時(shí)間[4]。在伴有轉(zhuǎn)移的腎癌病人外周血中分離出細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，其表面也可見CXCR4表達(dá)，且CXCR4在腎癌組織的表達(dá)程度與腫瘤轉(zhuǎn)移能力直接相關(guān)，在小鼠體內(nèi)抑制CXCL12/CXCR4軸可以廢止腎透明細(xì)胞癌向其它組織的轉(zhuǎn)移[5]。包括CXCL9在內(nèi)的干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的CXCR3配體可以參與免疫調(diào)節(jié)及血管生成[6,7]，在腎癌小鼠模型中聯(lián)用IL-2和CXCL9可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，減少腫瘤血管生成，增加CXCR3陽(yáng)性單核細(xì)胞向腫瘤的浸潤(rùn)[8]。在臨床上，基于CXCL9等因素構(gòu)建的ICL評(píng)分可以預(yù)測(cè)無(wú)轉(zhuǎn)移腎透明細(xì)胞癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[9]。

CCL5作為一種趨化因子，主要趨化單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等細(xì)胞向炎癥部位遷移，近年來(lái)，CCL5/CCR5軸在腫瘤中的生物學(xué)作用引起了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)CCL5/CCR5軸可以參與免疫調(diào)節(jié)，并與多種腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)[10,11]。在腎透明細(xì)胞癌中，患者血清中CCL5的濃度被證實(shí)明顯升高，同時(shí)CCL5在腎透明細(xì)胞癌組織樣本中的蛋白表達(dá)水平也顯著上調(diào)，并與患者的臨床病理分期正相關(guān)，與總生存時(shí)間負(fù)相關(guān)[12]，這提示CCL5有可能成為腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后判斷的分子學(xué)指標(biāo)。此外，CCL5介導(dǎo)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于腎透明細(xì)胞癌生物學(xué)行為的調(diào)控，特異性阻斷CCL5可以顯著抑制腎癌細(xì)胞的侵襲、遷移并可以延長(zhǎng)荷瘤小鼠的總生存時(shí)間，CCL5有望成為腎透明細(xì)胞癌臨床治療的潛在新靶點(diǎn)[13]。

綜上所述，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)腎透明細(xì)胞瘤基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了挖掘，篩選出腎透明細(xì)胞癌與正常腎組織差異表達(dá)基因并從生物學(xué)功能、參與通路等多角度進(jìn)行分析，進(jìn)一步甄別出20個(gè)樞紐基因，從分子水平為探討腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為腎透明細(xì)胞癌早期診斷及靶向治療提供了潛在線索，但這些關(guān)鍵基因的具體作用及相關(guān)機(jī)制后期還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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