操詹魁　王志玉

250012 濟(jì)南，山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院病毒學(xué)研究室

癌癥全球發(fā)病率近年呈上升趨勢，作為主要的死因之一，癌癥已嚴(yán)重威脅到人類健康和生命安全。常規(guī)的癌癥治療手段包括手術(shù)、放射和化療，療效值得肯定，但同時(shí)存在風(fēng)險(xiǎn)較高、副作用偏大、治愈率偏低等問題。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，病毒、基因療法等特異性高的癌癥治療手段不斷涌現(xiàn)，療效也有了明顯提高。溶瘤病毒(oncolytic virus)能選擇性在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，可產(chǎn)生直接的細(xì)胞毒作用，殺傷腫瘤細(xì)胞，也可作為基因治療載體、腫瘤疫苗等進(jìn)行腫瘤治療[1]。

新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV) 是具有溶瘤活性的單股負(fù)鏈RNA病毒，屬副粘病毒科、副粘病毒亞科、腮腺炎病毒屬，基因組全長約15 kb，含6種結(jié)構(gòu)基因(3′-NP-P-M-F-HN-L-5′)，分別編碼磷蛋白(phosphate protein, P)、核衣殼蛋白(nucleocapsid protein, NP)、基質(zhì)蛋白(matrix pro-tein, M)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase, HN)、融合蛋白(fusion, F)和大分子RNA聚合酶蛋白(large protein, L)[2]。NDV感染腫瘤細(xì)胞的過程需要HN和F兩種膜蛋白的參與。HN蛋白具有促細(xì)胞融合、受體識(shí)別和神經(jīng)氨酸酶活性，分別在病毒識(shí)別腫瘤細(xì)胞、膜融合和暴露腫瘤細(xì)胞抗原表位的過程中發(fā)揮重要作用[3]。F蛋白具有細(xì)胞融合活性，是決定病毒毒力的關(guān)鍵，在感染腫瘤細(xì)胞過程中與HN蛋白相互作用，共同介導(dǎo)病毒包膜和腫瘤細(xì)胞膜融合，使核糖核蛋白復(fù)合體(ribonucleoprotein complexes, RNPs)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，啟動(dòng)病毒復(fù)制過程[4]。

禽類感染NDV后發(fā)生新城疫，表現(xiàn)為黏膜出血、呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。人感染NDV后表現(xiàn)為輕微流感樣或結(jié)膜炎癥狀。20世紀(jì)70年代，匈牙利內(nèi)科大夫Csatary[5]發(fā)現(xiàn)罹患胃癌的農(nóng)場主在感染NDV后出現(xiàn)痊愈傾向，首次發(fā)現(xiàn)了NDV的抗腫瘤作用[6]。隨后大量的細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，其對惡性腫瘤有一定的療效，溶瘤療法也因此被認(rèn)為是一種新的、潛在的惡性腫瘤治療手段。近年來有學(xué)者利用反向遺傳學(xué)重組NDV病毒，使其溶瘤效果得到進(jìn)一步增強(qiáng)[7-9]。

1　NDV的體外抗腫瘤作用

NDV感染腫瘤細(xì)胞是其發(fā)揮抗腫瘤作用的第一步，腫瘤細(xì)胞表面分布有大量的唾液酸受體，HN蛋白識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面受體后，其同源四聚體頭部上抬， 頸部與F0蛋白相互作用，水解釋放融合肽介導(dǎo)NDV進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，開始NDV的復(fù)制和增殖[10]。Puhler等[11]拯救出標(biāo)記增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因的重組NDV病毒MTH-68，感染腫瘤細(xì)胞后，熒光觀察證實(shí)MTH-68能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。其后，不斷有研究表明癌細(xì)胞相比正常細(xì)胞對NDV敏感度更高，更易凋亡，且NDV的這種殺傷效應(yīng)與時(shí)間、劑量成正比[12-13]。NDV選擇性在腫瘤細(xì)胞復(fù)制并產(chǎn)生殺傷作用的機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞干擾素表達(dá)受阻有關(guān)，RNA病毒的復(fù)制會(huì)涉及雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)的合成，這種外源物質(zhì)能夠誘導(dǎo)基于Ⅰ型干擾素干擾素-α(interferon alpha, IFN-α)、干擾素-β(interferon alpha, IFN-β)的細(xì)胞防御系統(tǒng)，而腫瘤細(xì)胞干擾素表達(dá)缺陷，導(dǎo)致病毒在腫瘤細(xì)胞中的增殖不受抑制[14]。此外，Walter等[15]在研究干擾素對NDV復(fù)制的影響中發(fā)現(xiàn)，人胰腺癌細(xì)胞(human pancreatic carcinoma cells, HPACs)在接受IFN預(yù)處理后，細(xì)胞NDV病毒復(fù)制減少、細(xì)胞毒性下降，該實(shí)驗(yàn)間接證明了干擾素對NDV復(fù)制的抑制作用。NDV主要通過細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)揮抗腫瘤作用，還可刺激機(jī)體產(chǎn)生固有性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答來殺滅腫瘤細(xì)胞。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是NDV殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制。腫瘤細(xì)胞凋亡使自身產(chǎn)生免疫原性，引起趨化因子CXCL1、CCL2和CXCL10釋放，第一主要固有免疫應(yīng)答者中性粒細(xì)胞在趨化因子作用下向炎癥區(qū)域遷移，產(chǎn)生無菌性免疫應(yīng)答[16-17]。Elanku-maran 等[18]的研究表明，NDV主要通過內(nèi)源性信號途徑啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，也有部分是通過外源性信號途徑啟動(dòng)凋亡。內(nèi)源性腫瘤細(xì)胞凋亡由腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位擾動(dòng)引發(fā)通透性改變，釋放細(xì)胞色素-c和其他膜間隙蛋白，激活下游caspase-9，產(chǎn)生凋亡小體后激活下游caspase-3，引起腫瘤細(xì)胞凋亡[19]。外源性凋亡途徑可由凋亡配體物質(zhì)激發(fā)，激活蛋白水解酶caspase-8，進(jìn)而激活caspase-3、6、7、誘導(dǎo)級聯(lián)凋亡反應(yīng)[20]。NDV還在凋亡誘導(dǎo)配體(tumor nec-rosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL)的殺瘤活性中起重要作用，其原理是NDV能中和腫瘤壞死因子-γ(tumor necrosis factor-γ, TNF-γ)的抗體，解除了TRAIL表達(dá)的抑制，TRAIL 在激活NK 細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤殺傷效應(yīng)分子中發(fā)揮了重要的作用，增強(qiáng)了NK 細(xì)胞的腫瘤殺傷活性[21]。

NDV的P和NP蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)途徑來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬，細(xì)胞自噬是細(xì)胞對外界刺激如病毒感染的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)[22]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是多功能的細(xì)胞器，承擔(dān)功能主要有蛋白翻譯后修飾以及盤區(qū)折疊成蛋白質(zhì)。然而，細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)時(shí)可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[23]。自噬在固有性和適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，自噬細(xì)胞能夠釋放損傷相關(guān)模式分子(damage associated molecular patterns，DAMP)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，并且促進(jìn)樹突狀細(xì)胞(dend-ritic cells, DCs)將抗原交叉提呈給初始T細(xì)胞[24]。不斷有證據(jù)表明病毒溶瘤和細(xì)胞自噬的相互作用能增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答，刺激IFN-α、IFN-β、TNF-γ和白介素-1(interleukin-1, IL-1)等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在溶瘤病毒介導(dǎo)的癌細(xì)胞死亡中起重要的作用[25]。

2　NDV體內(nèi)抗腫瘤作用

近年來利用NDV抗腫瘤的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也有了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。由于天然NDV治療癌癥效果有限，反向遺傳技術(shù)一直是探索提高NDV溶瘤效果的途徑。研究人員在基因水平進(jìn)行NDV基因重組，病毒拯救成功后，對小鼠腫瘤模型進(jìn)行動(dòng)靜脈、皮下或瘤內(nèi)注射，觀察瘤體變化情況。Schwaiger[26]建立了6-8周齡雄性C57BL/6 N小鼠DT6606PDA細(xì)胞系胰腺腫瘤模型，體內(nèi)研究結(jié)果顯示在NDV R75全身感染后，受NDV激活的免疫細(xì)胞啟動(dòng)適應(yīng)性抗腫瘤免疫應(yīng)答，腫瘤生長得到抑制且不再復(fù)發(fā)。重組NDV的抑瘤作用會(huì)伴隨劇烈的炎癥反應(yīng)，自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)、巨噬細(xì)胞等增多，更易引起腫瘤細(xì)胞的凋亡[27]。除了炎性細(xì)胞外，腫瘤浸潤免疫T細(xì)胞在溶瘤過程中也發(fā)揮重要作用，其能特異性識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen, TAA)，該研究者將TAA基因重組到NDV病毒上，拯救成功后進(jìn)行瘤內(nèi)注射，瘤體明顯縮小，且出現(xiàn)強(qiáng)的適應(yīng)性抗腫瘤免疫應(yīng)答，在這一過程中，白介素-2(Interleukin-2, IL-2)能介導(dǎo)T細(xì)胞的活化，間接發(fā)揮抗腫瘤作用[28]。NDV病毒除了直接注射治療外，也可以用作基因載體進(jìn)行基因治療，cd作為自殺基因的典型代表能夠在載體的協(xié)助下導(dǎo)入癌細(xì)胞中，催化無毒的前體藥物5-氟胞嘧啶 (5-Fluorocytosine,5-FC)為5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)，發(fā)揮抗腫瘤作用。Lu等[29]使用NDV病毒株作為載體，通過基因重組方法成功構(gòu)建新型重組NDV rClone30-CD，并與5-FC聯(lián)用，建立起小鼠腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑢?shí)驗(yàn)證明重組NDV rClone30-CD/5-FC溶瘤系統(tǒng)具有很強(qiáng)抗腫瘤特性。未來的抗腫瘤治療將是在傳統(tǒng)放射、化療、手術(shù)療法的基礎(chǔ)上，結(jié)合基因及病毒治療高特異性和敏感性優(yōu)點(diǎn)，聯(lián)合進(jìn)行腫瘤治療。Meng等[30]對重組NDV D90的研究結(jié)果顯示，抗順鉑藥物的非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549在荷瘤裸鼠模型中被其誘導(dǎo)后凋亡，這提示重組NDV D90病毒株可以彌補(bǔ)化療藥物對某些腫瘤細(xì)胞敏感性不足的缺陷，增強(qiáng)其抗腫瘤作用。

3　應(yīng)用NDV進(jìn)行惡性腫瘤的臨床治療

目前研究發(fā)現(xiàn)NDV重組病毒對于晚期癌癥患者有一定的療效。Csatary等[31]早期使用減毒溶瘤疫苗菌株MTH-68/H進(jìn)行了一項(xiàng)抗腫瘤Ⅱ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示癌癥相關(guān)癥狀減少，高劑量組生存率比低劑量組高。由于NDV的潛在致病能力和倫理學(xué)要求，研究者們致力于提高NDV治療的安全性，Schulze T用NDV修飾的自體腫瘤疫苗(New castle disease virus-modified autologous tumor vaccine, ATV-NDV)對癌癥術(shù)后患者采取主動(dòng)特異性免疫治療(Active Specific Immunotherapy, ASI)，這項(xiàng)III期臨床試驗(yàn)研究隨訪了50例惡性結(jié)直腸癌患者，經(jīng)9-10年的隨訪觀察，結(jié)果顯示接種ATV-NDV的ASI療法能延長患者的總體生存率和無轉(zhuǎn)移生存率[32]。此外， Schirrmacher等[33]研究NDV腫瘤疫苗對免疫功能的影響中，將雙特異性抗CD28融合蛋白基因(bsHN-CD28)連接到ATV-NDV病毒載體，構(gòu)建重組腫瘤疫苗后對14位結(jié)直腸癌晚期患者進(jìn)行治療，結(jié)果顯示病毒修飾的自體腫瘤疫苗對肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)后結(jié)腸癌患者有效，腫瘤特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答得到增強(qiáng)。然而臨床試驗(yàn)證明，即使給患者多次施加大劑量的NDV，轉(zhuǎn)移癌也很難完全緩解，且容易復(fù)發(fā)，這可能是由于NDV動(dòng)靜脈轉(zhuǎn)移到腫瘤間隙的量不夠均一，或瘤內(nèi)NDV擴(kuò)散不良，不能達(dá)到有效的治療濃度，并且由于先天免疫、補(bǔ)體和細(xì)胞外基質(zhì)的阻礙，引起治療效果偏差，長期大量使用還可能引起腫瘤耐藥性增加[34]。因此，克服這些障礙對于增強(qiáng)NDV的溶瘤療效有重要意義。Shobana[35]通過合成雄激素類似物R1881增強(qiáng)前列腺癌CaP細(xì)胞的融合特性，誘導(dǎo)胞內(nèi)生成特異性前列腺抗原(prostate specific antigen, PSA)，針對該抗原在F蛋白上的切割位點(diǎn)設(shè)計(jì)出具有klql基序的rNDV，該重組病毒的前體蛋白F0僅能被PSA裂解激活，從而增強(qiáng)了NDV病毒在CaP細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的穩(wěn)定性和靶向性。

4　展望

NDV具有溶瘤及誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的作用，可用于治療傳統(tǒng)方法無效的惡性腫瘤，且安全性好、無嚴(yán)重不良反應(yīng)。重組NDV腫瘤疫苗的臨床試驗(yàn)研究為惡性腫瘤的治療提供了新的思路。隨著對NDV溶瘤作用研究的不斷深入及惡性腫瘤靶向治療技術(shù)的不斷成熟，其溶瘤效應(yīng)將得到進(jìn)一步增強(qiáng)，不良反應(yīng)也會(huì)減少，這將使其作為更加高效、安全的溶瘤因子，在臨床腫瘤治療方面的應(yīng)用將更具前景。

利益沖突:無

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