祝行琴

（浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310008）

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，大多患者確診時已屬晚期，喪失了手術(shù)治療的機會，因此放化療和靶向治療是晚期非小細胞肺癌治療的主要方式。EML4-ALK基因重排是非小細胞肺癌靶向治療的有效靶點之一，約5%患者攜帶有EML4-ALK基因重排，特別是非吸煙患者，突變率可達17%，該類患者可以從靶向ALK激酶的酪氨酸激酶抑制劑中獲益[1,2]。目前，常規(guī)的EML4-ALK基因重排的檢測方法是基于組織標本的免疫組化法、熒光原位雜交法、rt-PCR法以及高通量測序法[3,4]。然而存在部分晚期非小細胞肺癌患者無法進行組織活檢，因此基于血液標本的液體活檢技術(shù)給這類患者帶來了新的希望，但血液ALK重排檢測相對于EGFR基因檢測難度更大。下文對現(xiàn)階段血液ALK基因重排的檢測技術(shù)進行綜述，以促進晚期NSCLC患者ALK重排檢測的普及。

1.循環(huán)腫瘤細胞技術(shù)檢測ALK基因重排

近年來，研究表明循環(huán)腫瘤細胞也能用于EML4-ALK重排檢測，并且多個研究結(jié)果顯示，循環(huán)腫瘤細胞中EML4-ALK重排的檢測結(jié)果與組織活檢標本中的檢測結(jié)果具有較高的符合率[5,6]。2012年，Hofman, V.等人使用ISET技術(shù)（Isolation by size of epithelial tumour cell），根據(jù)循環(huán)腫瘤細胞直徑比正常血液細胞大的特征，使用特定尺寸的微孔濾膜將循環(huán)腫瘤細胞與血液細胞分離，直徑較大的循環(huán)腫瘤細胞留在濾膜上。微孔濾膜過濾技術(shù)的優(yōu)勢在于分離出的循環(huán)腫瘤細胞可以同時被用于下游的細胞形態(tài)學研究，因此可以通過一定的形態(tài)學判讀標準將分離出來的細胞進行更精準地分類[7]，此外，這種技術(shù)捕獲的循環(huán)腫瘤細胞也能用于下游免疫細胞化學或熒光原位雜交檢測。但是，這種方法的缺點在于很多患者常常僅能分離出不到100個循環(huán)腫瘤細胞，這就限制了判讀的陽性閾值。

2.血漿RNA檢測ALK重排

血漿循環(huán)游離DNA已經(jīng)較常規(guī)地被用于晚期非小細胞肺癌患者EGFR基因的突變檢測，然而血漿游離RNA卻并未被常規(guī)用于EML4-ALK重排的檢測，究其原因主要在于血漿RNA在抽血采樣后降解非常迅速，臨床上很難控制采血后能否及時地進行血漿RNA的分離和檢測，此外，血漿RNA中EML4-ALK的含量也較低，RT-PCR的最低檢測限也很難滿足常規(guī)的EML4-ALK檢測，因此限制了血漿RNA的臨床應(yīng)用。

3.血小板檢測ALK重排

近年來多個研究發(fā)現(xiàn)血小板的微囊泡結(jié)構(gòu)可以較好地將腫瘤RNA進行隔離保護[8,9]。腫瘤來源的血小板可以被用于富集腫瘤RNA進行EML4-ALK重排的檢測。有研究顯示血小板檢測EML4-ALK比血漿RNA檢測具有更高的特異性和敏感性，并且，在克唑替尼治療的患者中血小板EML4-ALK的存在預示著腫瘤的進展與不良的預后[10]，此外，血小板中EML4-ALK的再現(xiàn)是克唑替尼耐藥的一個標志，這種現(xiàn)象往往比影像學的進展提早了幾個月的時間。

4.二代測序技術(shù)檢測ALK重排

在晚期肺癌中，除了ALK重排外，其他基因重排例如ROS1、RET、NTRK等也同樣被發(fā)現(xiàn)與靶向治療相關(guān)，總體的突變率約為1-2%左右。因此，二代測序技術(shù)近年來被不斷地開發(fā)用于同時從血漿游離DNA中檢測這些基因組的異常[11,12]。基于雜交捕獲建庫，二代測序技術(shù)能同時檢測到基因重排、點突變、插入缺失、拷貝數(shù)變異等，但目前為止在血漿游離核酸標本中該技術(shù)檢測ALK基因重排的敏感性相對于組織標本來說還較低，在常規(guī)應(yīng)用于臨床之前還需要進一步的技術(shù)改進。

5.液體活檢檢測ALK重排的優(yōu)缺點

與EGFR液體活檢檢測優(yōu)缺點相似，ALK基因重排液體活檢具有下列優(yōu)勢：（1）液體活檢為非侵入性的檢測，具有無創(chuàng)或微創(chuàng)的特點，因此可以進行重復檢測，可以作為組織活檢的有效補充。例如當患者無法進行活檢手術(shù)或活檢組織不適合進行基因檢測時（腫瘤細胞太少、非正常福爾馬林固定、組織大面積壞死等）可以首先進行液體活檢檢測；（2）監(jiān)測靶向治療療效與腫瘤進展。液體活檢在靶向治療療效監(jiān)測中的應(yīng)用相對于組織活檢具有較顯著的優(yōu)勢。晚期肺癌患者可以在不同時間點進行多次液體活檢，以反映克唑替尼靶向治療后疾病的進展情況。值得一提的是液體活檢技術(shù)可以在影像學進展之前數(shù)月檢測到耐藥突變的產(chǎn)生，可以為臨床治療方案的調(diào)整提供依據(jù)。然而，ALK重排的液體活檢也存在不少的問題有待解決。首先是ALK重排的液體活檢技術(shù)目前還不是臨床的常規(guī)應(yīng)用技術(shù)，因此其重復性較大程度依賴于實驗操作的熟練度。其次，循環(huán)腫瘤細胞的捕獲技術(shù)也還未在臨床普遍開展，因此并非每個醫(yī)療機構(gòu)都能采用該技術(shù)。此外，上述技術(shù)對臨床外周血采樣后的血漿、血小板分離時效性要求較高，不合理的管理和操作均會顯著影響ALK重排的檢測結(jié)果。最后不能忽視的一個問題是患者個體間無論是循環(huán)腫瘤細胞還是游離核酸差異非常大，這取決于患者的腫瘤生物學特性，甚至在部分已經(jīng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的患者中依然僅存在極少量的循環(huán)腫瘤細胞或游離腫瘤核酸，并且，對于二代測序技術(shù)來說，一管10毫升的外周血中所分離到的循環(huán)腫瘤DNA往往不足以進行一次檢測。

6.總結(jié)與展望

液體活檢技術(shù)可以檢測ALK基因重排，包括循環(huán)腫瘤細胞、血漿和血小板，都具有較高的特異性，但敏感性差異較大，綜合應(yīng)用上述液體活檢技術(shù)將有助于提高ALK重排的檢出率。液體活檢檢測ALK重排的優(yōu)勢與EGFR基因突變的液體活檢類似，具備以下主要優(yōu)勢：（1）在無法獲取活檢組織時可以一定程度補充ALK基因重排的信息；（2）可以用于ALK基因耐藥突變的早期監(jiān)測；（3）可以用于靶向治療的療效監(jiān)測。綜上所述，目前液體活檢最大的挑戰(zhàn)在于如何提高檢測的敏感性以及如何優(yōu)化二代測序技術(shù)用于全面地檢測EGFR突變、ALK融合、ROS1融合、RET融合、NTKR融合等以及其他相關(guān)基因例如BRAF、HER2、Met等突變并且評估微衛(wèi)星穩(wěn)定性。這需要提高標本的管理響應(yīng)水平以及提高現(xiàn)有技術(shù)的敏感性。

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