脂肪干細(xì)胞在同種異體復(fù)合組織移植中的作用及其臨床應(yīng)用展望

王尹民 王秀俠 劉菲 楊軍

同種異體復(fù)合組織移植（Vascularized composite allograft transplantation，VCA），是指包括皮膚、肌肉、骨骼等帶血供的復(fù)合組織在同種異體間的移植。已有許多臨床應(yīng)用同種異體復(fù)合組織移植，如面部移植、肢體移植及腹壁移植的報(bào)道，為創(chuàng)傷后外觀及功能恢復(fù)提供了新的可能[1]。而與實(shí)體器官的同種異體移植類似，VCA同樣面臨著免疫排斥造成的抑制物壞死和功能障礙等問(wèn)題，因而免疫抑制劑的維持治療對(duì)于VCA是不可避免的[2]。接受異體復(fù)合組織移植的患者需終身服用免疫抑制劑，否則移植后短期內(nèi)會(huì)面臨急性免疫排斥反應(yīng)，長(zhǎng)期將面臨慢性免疫排斥反應(yīng)，從而導(dǎo)致移植物失去功能，并最終導(dǎo)致移植失敗。然而，免疫抑制劑的長(zhǎng)期使用造成的機(jī)會(huì)感染、繼發(fā)腫瘤、影響代謝等副作用，是目前臨床應(yīng)用中無(wú)法避免的問(wèn)題。

因此，VCA術(shù)后如何減少免疫抑制劑的用量，從而減輕或避免免疫抑制劑所帶來(lái)的副作用，是臨床一直積極探索的問(wèn)題。目前，聯(lián)合免疫抑制劑的細(xì)胞治療被認(rèn)為能一定程度上減少長(zhǎng)期免疫抑制劑的使用，并能同時(shí)維持移植物的存活和功能。

細(xì)胞治療種類包括干細(xì)胞治療和免疫細(xì)胞治療，其中間質(zhì)干細(xì)胞作為干細(xì)胞治療的一種，多用于自身免疫性疾病以及炎癥性疾病的治療。相較胚胎干細(xì)胞等其他干細(xì)胞類型，間質(zhì)干細(xì)胞涉及的倫理爭(zhēng)議更少，因而被用于臨床細(xì)胞治療的可行性更高；此外，由于間質(zhì)干細(xì)胞具有向內(nèi)胚層及外胚層組織分化的潛能，因此在修復(fù)重建過(guò)程中具有重要作用[3]。目前，間質(zhì)干細(xì)胞已被用于幫助緩解造血干細(xì)胞移植后移植物抗宿主病以及治療炎癥性腸病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等免疫性疾病[4-6]，也有大量的臨床前研究在探討其抑制性免疫調(diào)節(jié)作用和相關(guān)機(jī)制[7]。在同種異體復(fù)合組織移植方面，間質(zhì)干細(xì)胞治療的作用主要集中于抑制免疫排斥反應(yīng)，以及減輕缺血再灌注損傷等方面。而脂肪干細(xì)胞近年來(lái)備受關(guān)注，其來(lái)源廣泛且具有免疫調(diào)節(jié)作用，有望用于改善VCA術(shù)后移植物的存活[8]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞具有與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞相當(dāng)?shù)拿庖咭种谱饔?。Puissant等[9]的研究中顯示，脂肪干細(xì)胞不引起異體淋巴細(xì)胞增殖、抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，因而脂肪干細(xì)胞有可能替代較難獲取的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，成為發(fā)揮抑制免疫排斥反應(yīng)的重要細(xì)胞來(lái)源，從而用于同種異體復(fù)合組織移植后的治療。

1 脂肪干細(xì)胞及其在同種異體復(fù)合組織移植中的作用

脂肪干細(xì)胞來(lái)自于脂肪組織經(jīng)消化離心沉淀所得的基質(zhì)血管成分（Stromal Vascular Fraction，SVF），體外培養(yǎng)時(shí)呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)[10]。McIntosh等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)HLA-DR抗原量較原代細(xì)胞下降，不易引起異體免疫排斥反應(yīng)，為體外擴(kuò)增的異體脂肪干細(xì)胞用于細(xì)胞治療提供了重要前提。此外，在大鼠及豬的后肢移植模型中，多次應(yīng)用脂肪干細(xì)胞治療組相比對(duì)照組，移植物存活時(shí)間延長(zhǎng)。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中，脂肪干細(xì)胞表現(xiàn)出與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞相當(dāng)?shù)囊种泼庖吲懦夥磻?yīng)的能力[8，12]。已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)作用機(jī)制包括：通過(guò)旁分泌細(xì)胞因子抑制免疫排斥反應(yīng)、誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生、通過(guò)形成嵌合體誘導(dǎo)免疫耐受以及通過(guò)改善移植物缺血再灌注損傷從而改善移植后功能恢復(fù)等。

1.1 通過(guò)旁分泌細(xì)胞因子抑制免疫排斥反應(yīng)

Lee等[13]發(fā)現(xiàn)，在全厚皮移植的小鼠模型中，無(wú)論是給予脂肪干細(xì)胞或是脂肪細(xì)胞條件培養(yǎng)液，都能延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間，同時(shí)使得外周血炎癥因子IL-6及TNF-a含量下降，且實(shí)驗(yàn)組體外分離所得的T細(xì)胞對(duì)異體抗原的反應(yīng)性下降，說(shuō)明脂肪干細(xì)胞可通過(guò)旁分泌途徑減輕移植后免疫排斥反應(yīng)。此外，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，人脂肪干細(xì)胞能分泌前列腺素2（PGE2）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）等抑制性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，并能夠抑制體外混合淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，被認(rèn)為具有抑制免疫排斥反應(yīng)的能力[8，14]。有研究表明，脂肪干細(xì)胞在炎癥因子作用下吲哚胺2，3-二氧化酶（IDO）表達(dá)升高，在同混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)條件下環(huán)氧合酶COX-2（參與合成PGE-2）表達(dá)升高，而這些分子正參與抑制性免疫調(diào)節(jié)作用[15]。以上研究結(jié)果為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中脂肪干細(xì)胞能減少移植后炎癥因子表達(dá)并減輕炎癥反應(yīng)提供了解釋，提示脂肪干細(xì)胞受體內(nèi)環(huán)境中炎癥因子的刺激，IDO及COX-2等免疫調(diào)節(jié)分子表達(dá)升高，從而分泌抑制性免疫調(diào)節(jié)分子減輕移植免疫排斥反應(yīng)。

1.2 誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生

體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cell，Treg）可以抑制移植物免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。Bozulic等[16]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，免疫耐受的移植物中存在大量Treg浸潤(rùn)，而在發(fā)生排斥反應(yīng)的移植物中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的Treg浸潤(rùn)；且在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)Treg具有抑制淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的作用，同時(shí)Treg能夠分泌抑制性免疫調(diào)節(jié)因子IL-10[17]。因而，在同種異體移植中誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生，或外源性引入Treg，被認(rèn)為是有效的抑制免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的手段。而脂肪干細(xì)胞在移植中的免疫抑制作用被認(rèn)為與Treg產(chǎn)生并在移植物中累積相關(guān)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)輸注脂肪干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組相較對(duì)照組，外周血中的Treg水平更高，且較單獨(dú)使用免疫抑制劑更易達(dá)到免疫耐受狀態(tài)[18]。Song等[19]的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)處理的外周血單個(gè)核細(xì)胞中Treg比例上調(diào)，表明脂肪干細(xì)胞可誘導(dǎo)T細(xì)胞表達(dá)Treg特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子Foxp3，從而促進(jìn)Treg產(chǎn)生，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中脂肪干細(xì)胞促進(jìn)Treg產(chǎn)生從而誘導(dǎo)移植物免疫耐受提供了依據(jù)。脂肪干細(xì)胞可能通過(guò)旁分泌機(jī)制誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生，但具體何種旁分泌因子發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。

1.3 通過(guò)誘導(dǎo)嵌合體形成促進(jìn)免疫耐受

在同種異體移植中，嵌合體包括完全嵌合和混合嵌合，其中混合嵌合是指供體和受體的細(xì)胞在受體共存且彼此耐受。Leto等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，在移植骨髓細(xì)胞后可被檢測(cè)到的混合嵌合體存在時(shí)，受體免疫細(xì)胞對(duì)供體抗原刺激無(wú)反應(yīng)，即暫時(shí)達(dá)到免疫耐受狀態(tài)。該結(jié)果提示，誘導(dǎo)嵌合體產(chǎn)生及維持是引導(dǎo)免疫耐受形成的重要手段，而誘導(dǎo)嵌合的方式主要為聯(lián)合免疫抑制劑的供體骨髓細(xì)胞移植[21]。Mathes等[22]的研究表明，通過(guò)在胎兒期輸注供體骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)嵌合體產(chǎn)生，可引導(dǎo)長(zhǎng)期供體特異的免疫耐受產(chǎn)生。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，脂肪干細(xì)胞及少量骨髓間充干細(xì)胞的聯(lián)合應(yīng)用，延長(zhǎng)了移植物存活時(shí)間，維持了一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定的淋巴細(xì)胞嵌合狀態(tài)，其中嵌合狀態(tài)的維持被認(rèn)為與移植物存活延長(zhǎng)密切相關(guān)[23]。因此，我們推測(cè)促進(jìn)嵌合狀態(tài)的產(chǎn)生及維持也可能是脂肪干細(xì)胞能誘導(dǎo)免疫耐受的重要原因之一，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1.4 通過(guò)改善缺血再灌注損傷促進(jìn)移植物功能恢復(fù)

與實(shí)體器官移植類似，獲取移植物及移植過(guò)程涉及移植物缺血再灌注損傷這一病理過(guò)程。在VCA缺血再灌注損傷中，皮膚、肌肉及神經(jīng)系統(tǒng)均有累及，其中神經(jīng)系統(tǒng)損傷在缺血早期較為明顯。隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)肌肉損傷加重，甚至?xí)?dǎo)致移植后室筋膜綜合癥的發(fā)生。其病理生理過(guò)程涉及氧化應(yīng)激損傷及再灌注損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。在移植免疫這一特定條件下，由于炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的固有免疫及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的激活，將使得急慢性免疫排斥反應(yīng)更易發(fā)生[24]。而急慢性免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生將阻礙術(shù)后移植物功能恢復(fù)，甚至導(dǎo)致術(shù)后移植物壞死。Wang等[25]的研究表明，脂肪干細(xì)胞上清能減輕再灌注引起的微循環(huán)改變，包括改善血管痙攣及小動(dòng)脈血流停滯等。Shih等[26]的實(shí)驗(yàn)顯示，脂肪干細(xì)胞灌注改善了腎臟缺血再灌注模型的細(xì)胞凋亡，且發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。我們推測(cè)，在同樣具有缺血再灌注損傷的同種異體復(fù)合組織移植過(guò)程中，脂肪干細(xì)胞或其條件培養(yǎng)基能夠改善缺血再灌注損傷造成的微循環(huán)障礙及細(xì)胞損傷，也同樣是其能夠延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間及促進(jìn)移植術(shù)后功能恢復(fù)的原因之一。

2 脂肪干細(xì)胞臨床應(yīng)用于VCA術(shù)后的可能性

間質(zhì)干細(xì)胞在實(shí)體器官移植中已被用于臨床試驗(yàn)，而這也引發(fā)了關(guān)于臨床使用的時(shí)機(jī)、干細(xì)胞來(lái)源與擴(kuò)增方式及與免疫抑制劑的相互作用等實(shí)際應(yīng)用的相關(guān)問(wèn)題的討論[27]。以往臨床試驗(yàn)中，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（多采用體外擴(kuò)增培養(yǎng)的第3或 4 代細(xì)胞，1～2×106cells/Kg，20 min 內(nèi)靜脈推注）作為誘導(dǎo)治療方法之一，聯(lián)合抗IL-2抗體和鈣調(diào)磷酸酶抑制劑有效減少了急性免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，并可改善術(shù)后1年的腎功能[28]；同時(shí)，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞能有效減少病理水平的小管炎、間質(zhì)纖維化和小管萎縮[29]。由于脂肪干細(xì)胞與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞具有相當(dāng)?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)功能，因此也被研究用于VCA的臨床治療，但仍然面臨著細(xì)胞治療使用頻數(shù)、劑量及安全性等問(wèn)題。大鼠后肢移植模型的結(jié)果提示，術(shù)后多次使用脂肪干細(xì)胞治療移植物，其存活情況優(yōu)于單次或不使用干細(xì)胞的對(duì)照組，且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中脂肪干細(xì)胞治療無(wú)明顯不良反應(yīng)[30]。

此外，免疫抑制藥物與脂肪干細(xì)胞的相互作用也影響脂肪干細(xì)胞在體內(nèi)的作用，而這一點(diǎn)也與脂肪干細(xì)胞使用時(shí)機(jī)相關(guān)。Hoogduijn等[31]已經(jīng)證實(shí)，在體外高劑量免疫抑制劑可誘導(dǎo)間質(zhì)干細(xì)胞凋亡，但用小劑量他克莫司預(yù)處理的間質(zhì)干細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)有更好的抑制效果，而雷帕霉素則沒(méi)有這一效果，因而免疫抑制劑對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞的影響可能是雙向的。也有研究表明，在體外脂肪干細(xì)胞的活性及增殖能力相較骨髓間質(zhì)干細(xì)胞更易受他克莫司及抗淋巴細(xì)胞血清等免疫抑制劑的影響，因而在將來(lái)可能的脂肪干細(xì)胞臨床應(yīng)用中更需加強(qiáng)免疫抑制劑種類的選擇[32]。脂肪干細(xì)胞的臨床效果需要在進(jìn)一步的臨床前實(shí)驗(yàn)（如大動(dòng)物模型）中證實(shí)，合理選擇細(xì)胞用量、使用時(shí)機(jī)、聯(lián)合使用的免疫抑制劑是研究中需要謹(jǐn)慎考慮的問(wèn)題。

不同于實(shí)體器官移植，VCA由于包含了皮膚、肌肉、骨骼等多種組織，其急性免疫排斥反應(yīng)發(fā)生率更高，其中原因包括皮膚的特殊免疫原性和VCA患者相較實(shí)體器官移植患者基礎(chǔ)免疫防御功能更強(qiáng)[33]。脂肪干細(xì)胞治療在現(xiàn)階段體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中有助于提高移植物存活時(shí)間、誘導(dǎo)移植物免疫耐受、減少免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，在體外能抑制淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。而在發(fā)生急性免疫排斥反應(yīng)時(shí)，脂肪干細(xì)胞是否具有抑制免疫排斥反應(yīng)的效果還有待進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。其他細(xì)胞治療普遍存在的安全問(wèn)題，如致瘤性、細(xì)胞異位遷徙分化以及細(xì)胞體外擴(kuò)增可能造成的污染等也有待排除。此外，脂肪干細(xì)胞真正用于治療時(shí)的經(jīng)濟(jì)效益也需審慎考量。

3 結(jié)論與展望

Lalande等[34]在研究中引入了對(duì)細(xì)胞功能表現(xiàn)幾乎無(wú)影響的細(xì)胞體內(nèi)示蹤技術(shù)，通過(guò)磁性納米微粒標(biāo)記特定用于組織修復(fù)重建的細(xì)胞群，并通過(guò)磁共振成像技術(shù)體外動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞在體內(nèi)的分布可持續(xù)4周以上。類似的示蹤技術(shù)，其標(biāo)記的細(xì)胞被磁性微粒標(biāo)記后可受磁場(chǎng)作用，在體外支架上重新分布再定位并能被監(jiān)測(cè)[35]。這些技術(shù)有望被用于脂肪干細(xì)胞治療的進(jìn)一步研究中，觀察如何通過(guò)細(xì)胞趨化等作用使得細(xì)胞在特定組織器官發(fā)揮作用，從而改善單純靜脈輸注細(xì)胞治療的針對(duì)性不足的問(wèn)題，減少不必要的損耗。

脂肪干細(xì)胞由于具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相當(dāng)?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)能力，以及改善移植過(guò)程中組織損傷的功能，且來(lái)源廣泛，具有一定的體外擴(kuò)增能力，可能被用于同種異體復(fù)合組織移植的治療，從而減少長(zhǎng)期免疫抑制劑的用量，但這仍需臨床應(yīng)用前進(jìn)一步的評(píng)估及安全考量。新近的細(xì)胞追蹤技術(shù)為脂肪干細(xì)胞體內(nèi)應(yīng)用后的分布定位和功能狀態(tài)觀察提供了依據(jù)，或可應(yīng)用于脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞治療作用及安全性的評(píng)估，相信將有利于細(xì)胞治療在臨床的進(jìn)一步開(kāi)展。