聚丙烯酰胺凝膠與毛細(xì)管電泳檢測龍須菜SSR位點(diǎn)的比較研究?

胡依依， 隋正紅， 彭 沖， 米 萍， 姜敏杰， 李曉東， 阮旭東

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)作為一種重要的產(chǎn)瓊膠紅藻[1-2]，在具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的同時，還能食用[3]及作為鮑魚餌料，并且具有一定的藥用價(jià)值[4-5]。它還能吸收N、P元素，修復(fù)水體富營養(yǎng)化[6]，保持生態(tài)平衡[7-9]。

簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSR)亦稱微衛(wèi)星，屬于串聯(lián)重復(fù)序列，以1～6 bp長度為重復(fù)單元，重復(fù)多次后長度可達(dá)幾十至幾百bp，廣泛分布于基因組中[10]。根據(jù)SSR兩端的保守序列可設(shè)計(jì)特異性引物，從而對SSR片段進(jìn)行擴(kuò)增。SSR片段的長度會由于重復(fù)次數(shù)的改變而產(chǎn)生變化[11]，可以通過電泳來分離及檢測。目前SSR研究主要集中在遺傳多樣性分析、種群結(jié)構(gòu)分析、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等方面[12-15]。

為準(zhǔn)確揭示SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，開發(fā)出可利用的分子標(biāo)記，通常利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)與毛細(xì)管電泳來實(shí)現(xiàn)最小1～6 bp的多態(tài)性片段的分離。本實(shí)驗(yàn)以12個野生型龍須菜個體為材料，選擇7個SSR位點(diǎn)，分別使用PAGE電泳銀染檢測和毛細(xì)管電泳熒光檢測每個位點(diǎn)的多態(tài)性信息，并對這2種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行了比較與檢驗(yàn)，旨在探究準(zhǔn)確可信的多態(tài)性SSR位點(diǎn)的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選取12個野生型龍須菜配子體個體作為實(shí)驗(yàn)材料，分別采集自青島雕塑園(36°4′31″N,120°27′29″E)，青島湛山灣(36°3′16″N,120°21′57″E)和威海石島(36°51′54″N,122°24′41″E)，每個地點(diǎn)采集4個個體。

藻體經(jīng)毛筆刷洗后去除表面附著的泥沙與雜藻，在加有Pro培養(yǎng)基的無菌海水中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度設(shè)置為20 ℃，光照條件為3 500 lux，光暗周期為12 h∶12 h。提取基因組DNA前切取藻體新鮮幼嫩部分，使用無菌蒸餾水沖洗幾遍后吸干藻段表面水分，待用。

1.2 基因組DNA的提取

用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取龍須菜基因組DNA。0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，并利用核酸蛋白質(zhì)檢測儀檢測A260/A280、A260/A230以及DNA濃度。

1.3 SSR引物擴(kuò)增

SSR位點(diǎn)從龍須菜genome survey的組裝序列中獲得[16]，選擇7個SSR位點(diǎn)，基于側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，具體引物信息見表1。每對引物退火溫度的篩選以12個龍須菜個體的混合樣為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL反應(yīng)體系中各反應(yīng)物含量：2.0 μL 10×PCR Buffer，1.5 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTP，0.5 μmol/L正向和反向引物，20 ng 模板DNA，0.5 UTaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性 1 min，溫度梯度退火 1 min，72 ℃ 延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min； 4 ℃保存待用。其中退火溫度梯度在55～65 ℃設(shè)置5個溫度值分別為：55.0、56.9、58.7、63.0、65.0 ℃。

3 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果，篩選每對SSR引物最合適的退火溫度。隨后每對引物以12個龍須菜個體為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系與反應(yīng)條件與篩選退火溫度時相同。

1.4 SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

1.4.1 PAGE檢測 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在10 %非變性聚丙烯酰氨凝膠上進(jìn)行分離。60 W恒功率預(yù)電泳30 min，電泳1 h 50 min。電泳結(jié)束后將凝膠浸入1g/L AgNO3染色液中染色20 min；隨后轉(zhuǎn)移入去離子水中，漂洗10 s，以去除凝膠表明附著的AgNO3；再迅速轉(zhuǎn)移到15 g/L NaOH+ 0.3 g/L NaCO3+ 3 mL/L甲醛顯色液中顯色15 min左右；最后用蒸餾水緩緩沖洗掉凝膠表面的殘余液，置于通風(fēng)處晾干保存。每一個SSR位點(diǎn)的多態(tài)性是根據(jù)PAGE膠上不同個體的目的條帶之間是否出現(xiàn)明顯的分離來判讀的。

1.4.2 毛細(xì)管電泳檢測 將表1中7對引物合成為FAM標(biāo)記的熒光引物，其中引物H97再合成1對ROX標(biāo)記引物，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系與程序同1.3。利用ABI 3730XL測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，得到原始數(shù)據(jù)后使用軟件Gene Mapper 4.0進(jìn)行分析并生成分型信息和峰圖。毛細(xì)管電泳分型由上海生工生物有限公司完成。

1.4.3 測序檢測 對待檢測引物的所有PAGE條帶進(jìn)行切膠回收，具體步驟為：切下目的條帶，置于潔凈的載玻片上并滴加1～2滴ddH2O，蓋上蓋玻片后用力碾碎，將碾碎的膠轉(zhuǎn)移至離心管中，加入25 μL ddH2O，100 ℃金屬浴15 min，13 800g離心2 min后吸取上清，作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系及程序同1.3。3 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物質(zhì)量合格后送測序。測序由華大基因完成。

表1 本實(shí)驗(yàn)采用的7對SSR引物序列特征Table 1 Characteristic of 7 SSR primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 PAGE檢測結(jié)果

根據(jù)PAGE凝膠上不同個體間差異性條帶的判讀，得到每一對引物在12個個體中的等位基因數(shù)目(見表2)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，等位基因數(shù)目為2個的多態(tài)性SSR位點(diǎn)包括三堿基重復(fù)的S25、S28和六堿基重復(fù)的S96；非多態(tài)性SSR位點(diǎn)包括三堿基重復(fù)的H30，五堿基重復(fù)的H88和六堿基重復(fù)的H97、H98。

2.2 毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果

毛細(xì)管電泳后，各個體泳道內(nèi)的DNA片段大小可通過與分子量內(nèi)標(biāo)的比較而精確獲得，如表2所示，為便于個體間比較，將DNA片段大小四舍五入后保留整數(shù)位。引物H30在12個個體中共出現(xiàn)了3種分型結(jié)果即137、139和140 bp。已知該SSR位點(diǎn)是三堿基重復(fù)序列，因此不同等位基因之間差異3 bp及其倍數(shù)，而毛細(xì)管電泳結(jié)果中卻出現(xiàn)了1和2 bp的差異。通過觀察峰圖發(fā)現(xiàn)這種差異可能是目標(biāo)峰讀取不準(zhǔn)確造成的。如圖1所示，第10號個體(139 bp)和第11號個體(140 bp)的峰圖中都存在兩個緊密相連且看起來高度相等的峰，這兩個峰分別為一個目標(biāo)峰和一個懷疑峰，這種情況的產(chǎn)生通常是由于PCR產(chǎn)物濃度偏大，毛細(xì)管電泳后檢測到的熒光信號強(qiáng)，峰值高度高，峰圖上無法完整顯示出兩峰的高度，而Gene Mapper軟件在處理原始熒光數(shù)據(jù)時會將兩峰中實(shí)際高度更高的峰認(rèn)定為目標(biāo)峰(藍(lán)色實(shí)心標(biāo)注)，這種目標(biāo)峰的確定方式可能會造成1 bp的分子量差異。第12號個體的峰圖未出現(xiàn)上述情況，直接依據(jù)峰圖讀取目標(biāo)片段的分子量大小為137 bp。因此引物H30最終分型結(jié)果為1～11號個體為1種等位基因，分子量大小均為140 bp；第12號個體為第2種等位基因，分子量大小為137 bp。

圖1 龍須菜個體10、11、12號在SSR位點(diǎn)H30上的毛細(xì)管電泳峰圖

另外，表2中引物H88在7號個體上所檢測的目標(biāo)片段分子量(108 bp)與其他個體(106 bp)相差2 bp。由圖2觀察到7號個體的目標(biāo)峰單一，不存在懷疑峰，而以9號個體作為其余個體的代表，其目標(biāo)峰單一，亦不存在懷疑峰。說明2 bp分子量差異不是由目標(biāo)峰的選擇造成的。又知該位點(diǎn)是五堿基重復(fù)序列，等位基因大小應(yīng)該差異5 bp及其倍數(shù)，2 bp不足以構(gòu)成一個 重復(fù)單元，也就不足以構(gòu)成一個新的等位基因，因此7號個體與其余個體具有相同的1種等位基因，即H88位點(diǎn)在12個個體中沒有多態(tài)性。

圖2 龍須菜個體7號和9號在SSR位點(diǎn)H88上的毛細(xì)管電泳峰圖

根據(jù)上述分析方法，排除由目標(biāo)峰的選擇造成的1 bp差異以及非重復(fù)單元長度差異的影響后，得到7個SSR位點(diǎn)的毛細(xì)管電泳分型結(jié)果為：等位基因數(shù)目為2個的多態(tài)性SSR位點(diǎn)包括三堿基重復(fù)的H30和六堿基重復(fù)的S96；非多態(tài)性SSR位點(diǎn)包括三堿基重復(fù)的S25、S28，五堿基重復(fù)的H88和六堿基重復(fù)的H97、H98。

2.3 兩種方法的檢測結(jié)果比較與測序驗(yàn)證

PAGE與毛細(xì)管電泳分型結(jié)果相一致的位點(diǎn)包括全部的五堿基和六堿基重復(fù)：H88、S96、H97和H98。而分型結(jié)果不一致的位點(diǎn)則均為三堿基重復(fù)：H30、S25和S28。這3個位點(diǎn)的PAGE結(jié)果見圖3：H30位點(diǎn)在所有個體間的條帶彼此沒有分離開，判讀該位點(diǎn)無多態(tài)性，但毛細(xì)管電泳分型結(jié)果為12號個體與其他個體在該位點(diǎn)上相差一個單位長度3 bp；S25位點(diǎn)的7號個體的條帶與其他條帶分離開，S28位點(diǎn)的2、3、4、5、8號個體的條帶與其他條帶分離開，均被判讀為擁有2個等位基因的多態(tài)性位點(diǎn)，但毛細(xì)管電泳分型結(jié)果均顯示12個個體無分子量差異。

圖3 龍須菜12個個體在SSR位點(diǎn)H30、S25和S28上的PAGE結(jié)果圖

針對這3個位點(diǎn)，對每一個個體的PAGE條帶進(jìn)行切膠回收，以回收產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果顯示：H30位點(diǎn)在12個個體上的SSR序列均為TCTTCTTCTTCT即(TCT)4，證明故該位點(diǎn)沒有多態(tài)性，與PAGE判讀結(jié)果一致；S25位點(diǎn)在7號個體上的SSR序列為(TTC)3，其余為(TTC)4，與PAGE結(jié)果一致；S28位點(diǎn)在第2、3、4、5、8號個體的SSR序列為(TTC)5，其余為(TTC)6，與PAGE結(jié)果一致。

經(jīng)過測序檢驗(yàn)，PAGE膠中顯示的多態(tài)性條帶是由重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)的差異造成的，PAGE的分型結(jié)果相比于毛細(xì)管電泳更加準(zhǔn)確可信。

3 討論

3.1 PAGE電泳檢測SSR的方法探究

有研究表明[17]，在進(jìn)行SSR檢測時，變性膠相比與非變性膠能更清晰地分離雜合子條帶，有效減少非特異性條帶，獲得更好的電泳效果。因此實(shí)驗(yàn)初期分別用變性膠和非變性膠進(jìn)行SSR檢測以期比較兩者之間的差異，但多次對比后發(fā)現(xiàn)電泳效果一致。由于變性膠能使分子質(zhì)量相差較大的兩條DNA鏈分開導(dǎo)致電泳后產(chǎn)生兩條帶，從而對分型結(jié)果產(chǎn)生誤導(dǎo)，再加上制作與操作過程都較之非變性膠復(fù)雜，因此本實(shí)驗(yàn)采用非變性膠進(jìn)行電泳。

若想通過PAGE電泳準(zhǔn)確、全面的判斷SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，就需要得到清晰且位置準(zhǔn)確的條帶，從而判斷不同個體之間的條帶是否具有長度差異，進(jìn)而統(tǒng)計(jì)多態(tài)性信息。通過實(shí)驗(yàn)過程中對PAGE膠質(zhì)量、濃度、電壓大小、PCR產(chǎn)物上樣量等因素的探究，得到以下技術(shù)經(jīng)驗(yàn)：

熟練掌握制膠技術(shù)，達(dá)到凝膠厚薄一致且質(zhì)地均勻，以利于電泳分離條帶；適當(dāng)提高膠濃度，同時適當(dāng)降低電壓，以增加凝膠的有效分離范圍；優(yōu)化PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，篩選合適的退火溫度，從而減少非特異性擴(kuò)增，保證目的條帶的擴(kuò)增效率；適當(dāng)降低PCR產(chǎn)物上樣量，使條帶變窄易于分離，或者通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物先進(jìn)行定量，再根據(jù)各自定量結(jié)果選擇合適的上樣量，其目的在于盡量保證所有條帶的寬窄一致，利于多態(tài)性的正確判定。

3.2 PAGE電泳與毛細(xì)管電泳檢測SSR方法比較

毛細(xì)管電泳在判讀目的條帶的分子量大小時，有分子內(nèi)標(biāo)作為參照，因此十分靈敏。當(dāng)檢測的個體數(shù)目很多而且等位變異也很多時，相比PAGE電泳更具有高效性。陳雅瓊等[18]對9份煙草材料的1個SSR位點(diǎn)進(jìn)行PAGE檢測和毛細(xì)管電泳檢測時，PAGE擴(kuò)增帶型清晰，毛細(xì)管電泳檢測出兩種分子量大小93和113 bp，分子量大小差異為20 bp，這與所挑選引物多態(tài)性高有關(guān)。在玉米的研究中[19]，以192份玉米為材料，對7個SSR位點(diǎn)進(jìn)行兩種電泳方法的檢測，2種方法檢測的結(jié)果一致，SSR位點(diǎn)的等位基因數(shù)目為4～13。郝晨陽等[20]對451份北方冬麥的24個SSR位點(diǎn)進(jìn)行多重毛細(xì)管電泳熒光檢測和PAGE銀染分析，PAGE銀染技術(shù)檢測出每個SSR位點(diǎn)的等位變異數(shù)目為3～20，熒光標(biāo)記技術(shù)檢測出每個SSR位點(diǎn)的等位變異數(shù)目為4～24，在每個SSR位點(diǎn)上熒光標(biāo)記技術(shù)比PAGE銀染技術(shù)平均多檢測到3個等位變異。這些研究結(jié)果反映出當(dāng)?shù)任换虻姆肿恿坎町愝^大，或者等位基因數(shù)目較多時，毛細(xì)管電泳的準(zhǔn)確性很高；尤其在對大量材料進(jìn)行檢測時，毛細(xì)管電泳無論在檢測準(zhǔn)確性還是檢測效率上都更理想。但本實(shí)驗(yàn)的個體數(shù)量少，等位變異少，所檢測的SSR位點(diǎn)在不同個體之間最多差異一個重復(fù)單元。此時一旦目標(biāo)峰讀取產(chǎn)生誤差，就可能會產(chǎn)生長度差異從而造成假陽性的多態(tài)性結(jié)果，或者漏掉等位變異而造成假陰性結(jié)果。因此本實(shí)驗(yàn)中相比三堿基重復(fù)位點(diǎn)，五、六堿基重復(fù)位點(diǎn)的重復(fù)單元長度更長，分子量差異更大，能更好的避免誤差，毛細(xì)管電泳結(jié)果就準(zhǔn)確。若想要使毛細(xì)管電泳中目標(biāo)峰的讀取毫無誤差，就需要通過優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件、優(yōu)化電泳過程、熟練掌握軟件操作方法、重復(fù)檢測等手段來獲得理想峰圖，準(zhǔn)確地識別目標(biāo)峰并精確地讀取目標(biāo)片段的分子量大小。

另外，毛細(xì)管電泳結(jié)果中有個別個體熒光峰圖缺失，比如8號子代的H88位點(diǎn)，補(bǔ)測后仍然沒有峰圖，但是該個體的PAGE結(jié)果中有目的條帶，因此排除無效等位基因的可能性[21-23]。如果只依靠毛細(xì)管電泳結(jié)果則無法判斷是熒光信號丟失還是無效等位基因。

本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了2對不同熒光標(biāo)記(FAM和ROX)的SSR引物的混合檢測，即FAM標(biāo)記的H88和ROX標(biāo)記的H97的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(分子量相差50 bp)一起進(jìn)行電泳，再根據(jù)不同的熒光標(biāo)記分別讀取分子量大小。混合檢測的結(jié)果與單獨(dú)檢測的結(jié)果相比較時發(fā)現(xiàn)，位點(diǎn)H97在混合檢測時分子量大小為160 bp，單獨(dú)檢測時則為156 bp，說明混合檢測也需要一定的優(yōu)化與重復(fù)才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)中PAGE電泳結(jié)果均通過測序驗(yàn)證了分型的準(zhǔn)確性。如果以測序作為一種直接檢測SSR位點(diǎn)多態(tài)性的手段，需要先進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測目的條帶：如果是用瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，由于瓊脂糖凝膠的分辨率低，無法區(qū)分差異幾個堿基的擴(kuò)增片段，只能利用電泳結(jié)果確定目的條帶，然后切膠回收測序，但是當(dāng)樣品數(shù)目多，SSR位點(diǎn)數(shù)目多時，測序費(fèi)用不菲且操作繁瑣；如果是用PAGE檢測目的條帶，由于PAGE膠的分辨率高，理論上1個堿基的差異就可以分開，建議直接通過電泳結(jié)果讀取SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，除非PAGE電泳結(jié)果優(yōu)化后仍然不足以判定多態(tài)性信息，再切膠進(jìn)行測序檢測。

綜合上述因素，當(dāng)樣本量少，SSR位點(diǎn)的變異小時，毛細(xì)管電泳分型標(biāo)準(zhǔn)的確立與PAGE電泳判讀標(biāo)準(zhǔn)的確立相比更加復(fù)雜，建議選擇PAGE電泳來檢測SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，既能節(jié)省較之普通引物昂貴很多的熒光引物的合成費(fèi)用及試劑、儀器成本，又能保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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