王丹 滕懿群 黃蓉

2015年美國(guó)總統(tǒng)奧巴馬在年度國(guó)情咨文演講中提出了“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃”[1-2]，這一概念的提出將“遺傳醫(yī)學(xué)-基因組學(xué)-個(gè)體化醫(yī)學(xué)”的發(fā)展提升到前所未有的高度。目前在“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃”的具體實(shí)施過程中，兒童遺傳性疾病是最具實(shí)踐意義的方向之一。最近幾年基因組學(xué)的發(fā)展，使許多遺傳性疾病的診斷與治療正經(jīng)歷著革命性的變化。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，特別是基因組學(xué)的興起以及測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，使我們對(duì)遺傳性疾病的認(rèn)識(shí)由細(xì)胞水平進(jìn)入分子水平，對(duì)眾多疾病的發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)，在診斷、治療和預(yù)防方面開辟了新的途徑。目前，高通量測(cè)序已發(fā)展為遺傳性疾病診斷的首選方法。該技術(shù)可以在分子水平準(zhǔn)確進(jìn)行疾病診斷與分型，在某些方面，優(yōu)于一代測(cè)序、串聯(lián)質(zhì)譜-氣相色譜檢測(cè)[3]等其他檢測(cè)技術(shù)，但也存在一定局限性。

高通量測(cè)序，即下一代測(cè)序，也稱大規(guī)模平行測(cè)序、二代測(cè)序，是近幾年誕生的全新DNA測(cè)序技術(shù)，它能同時(shí)對(duì)幾十萬甚至幾百萬DNA分子進(jìn)行平行測(cè)序，主要特點(diǎn)是邊合成邊測(cè)序，與傳統(tǒng)的一代測(cè)序技術(shù)（Sanger測(cè)序）相比，具有高通量及高敏感性等優(yōu)勢(shì)。高通量測(cè)序主要是待測(cè)序的片段化的基因組DNA與通用的接頭連接，然后通過不同的方法產(chǎn)生成千上萬的單分子多克隆聚合酶鏈反應(yīng)

（PCR）陣列，并進(jìn)行引物雜交和酶延伸反應(yīng)，這些反應(yīng)可以同時(shí)對(duì)幾十萬甚至幾百萬DNA分子進(jìn)行平行測(cè)序，最終得到的測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)軟件分析可獲得較完整的DNA序列信息[4]。目前高通量測(cè)序的主要平臺(tái)代表有瑞士羅氏公司（Roche）的 454測(cè)序儀（Roche GS FLX sequencer），美國(guó)ABI的 SOLiD 測(cè)序儀（ABI SOLiD sequencer）和美國(guó) Illumina公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer）[5]。本文就近幾年高通量測(cè)序在新生兒遺傳學(xué)疾病診治的應(yīng)用方面進(jìn)行綜述，為疑似遺傳性疾病的疑難、危重新生兒提供診治新思路，提高整體的診治水平。

1 高通量測(cè)序的方法和技術(shù)原理

1.1 Roche/454 454公司首先將焦磷酸測(cè)序應(yīng)用在測(cè)序技術(shù)上，之后被Roche診斷公司收購(gòu)，形成了目前的Roche/454。主要是將待測(cè)DNA樣品打斷成300～800bp的片段后，在3'和5'端分別加上接頭，這些接頭會(huì)使DNA片段結(jié)合到磁珠上，并形成樣本文庫。再將包含磁珠和擴(kuò)增試劑的水溶液注入礦物油中，稱為“小水滴”，即形成油包水結(jié)構(gòu)，每個(gè)小水滴只包含1個(gè)DNA模板。擴(kuò)增反應(yīng)在此結(jié)構(gòu)中單獨(dú)進(jìn)行。擴(kuò)增后，DNA分子富集，磁珠上進(jìn)行焦磷酸反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后每個(gè)磁珠只能形成1個(gè)讀長(zhǎng)，通過GS-FLX系統(tǒng)分析，將引物上脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）的聚合與熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)，通過檢測(cè)熒光信號(hào)，進(jìn)行DNA測(cè)序。Roche/454測(cè)序儀的測(cè)序通道體積非常狹小，只能容納1個(gè)微珠。相對(duì)其他2種測(cè)序方法，其具有測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，可以提供中等的讀長(zhǎng)和適中的價(jià)格，適用于新物種基因組、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等，但也可能產(chǎn)生誤差[6]。

1.2 ABI/Solid 其技術(shù)的核心是4種熒光標(biāo)記寡核苷酸的連接反應(yīng)[7]。在文庫構(gòu)建和PCR擴(kuò)增方面，和Roche/454基本相同，測(cè)序之前，DNA模板通過乳化PCR擴(kuò)增，只是ABI/Solid的微珠更小，只有1μm。連接測(cè)序所用的底物是8個(gè)堿基熒光探針混合物，根據(jù)序列的位置，樣品DNA就可以被探針標(biāo)記。DNA連接酶優(yōu)先連接和模板配對(duì)的探針，并引發(fā)該位點(diǎn)的熒光信號(hào)的產(chǎn)生。其優(yōu)點(diǎn)在于讀長(zhǎng)只有50～75bp，精確度可達(dá)Q40，適于基因組重測(cè)序和單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)。ABI/Solid系統(tǒng)在測(cè)序過程中對(duì)每個(gè)堿基判讀2次，從而減少原始數(shù)據(jù)錯(cuò)誤；使用連接酶替代聚合酶，能明顯減少因堿基錯(cuò)配而出現(xiàn)的錯(cuò)誤；測(cè)序過程中由于存在更換引物，可以減少錯(cuò)誤率，確保精確度，是目前下一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度相對(duì)較高的。

1.3 Illumina/Solexa 其測(cè)序核心是“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)”，原理是可逆性終止化學(xué)反應(yīng)[8]。DNA片段兩段加上接頭之后，可固定到芯片表面，形成DNA文庫，芯片表面連接與接頭互補(bǔ)的寡核苷酸，形成橋結(jié)構(gòu)（即DNA簇），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后形成的數(shù)千份相同的單克隆DNA簇被用作測(cè)序模板。測(cè)序時(shí)利用“可逆終止子”進(jìn)行邊合成邊測(cè)序的方法，直至測(cè)序結(jié)束。由于測(cè)序過程是可逆的，保證了測(cè)序的準(zhǔn)確性，有效減少錯(cuò)誤摻入，且成本相對(duì)低，適用于小RNA測(cè)序、甲基化、全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）等。

目前，高通量測(cè)序已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于臨床實(shí)踐領(lǐng)域[5，7]。高通量測(cè)序按照測(cè)序覆蓋范圍大小大致分為以下幾種：WGS、全外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing，WES）、靶向目標(biāo)基因測(cè)序。其中WGS能對(duì)基因組水平的變異作最全面和深入的研究，但由于目前所需費(fèi)用較昂貴，海量測(cè)序數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存和分析難度較大等原因，暫時(shí)未能在實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用。一些原理驗(yàn)證研究已證實(shí)WES應(yīng)用于臨床診斷是可行的，且在遺傳性疾病的診斷方面體現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，目前已經(jīng)成為疾病基因研究和分子標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的重要工具[9]。靶向目標(biāo)基因測(cè)序通過對(duì)疾病所有已知相關(guān)的致病基因作單管平行檢測(cè)，能最大限度地發(fā)揮高通量測(cè)序在遺傳性疾病領(lǐng)域的優(yōu)越性，同時(shí)很大程度上可避免WGS和WES產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)對(duì)下游生物信息學(xué)分析和解讀造成的困難，因此非常適合臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)罕見遺傳性疾病進(jìn)行分子診斷[10]。

2 高通量測(cè)序與新生兒遺傳性疾病

遺傳性疾病是指由于人體遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生改變而引起的或者是由致病基因所控制的疾病[11]，這類疾病通常因基因突變所致?；虻膬?nèi)部結(jié)構(gòu)及功能極其復(fù)雜，對(duì)損傷極其敏感，在損傷中基因通常容易發(fā)生突變，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。遺傳性疾病一般分為5大類：染色體病、單基因遺傳性疾病、多基因遺傳性疾病、線粒體病、基因組印記[12]。根據(jù)在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)，目前已報(bào)道的單基因遺傳性疾?。ū硇停┘s有7 000多種，其中已明確致病基因的約4 000多種。遺傳性疾病在兒科臨床診療工作中十分常見，涉及范圍極為廣泛，尤其是新生兒科。遺傳性疾病在新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房的比例也逐漸增高，保守估計(jì)中國(guó)目前有1 000萬余罕見病患兒，同時(shí)每年約有90萬存在出生缺陷的孩子出生，其臨床癥狀及致病原因極為復(fù)雜。筆者在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，疑難、危重新生兒越來越多，往往診斷困難，治療效果欠佳，而此類患者往往是遺傳性疾病患者的重要組成部分。

近些年來高通量測(cè)序逐漸成熟，2009年，Ng等[13]首次報(bào)道了WES用于臨床診斷的研究結(jié)果。目前高通量測(cè)序廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，如腫瘤[14]、臨床樣本檢測(cè)[15]、基因檢測(cè)[3]、遺傳性疾病[4]等，已經(jīng)成為臨床研究領(lǐng)域的重要工具。并且在兒童遺傳性疾病方面的應(yīng)用，已進(jìn)行了初步的嘗試，證實(shí)其在新生兒疾病精準(zhǔn)治療領(lǐng)域具有可行性。就現(xiàn)狀而言，高通量測(cè)序在新生兒領(lǐng)域的應(yīng)用主要針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病、發(fā)育異常、先天畸形、代謝異常、合并多臟器功能損傷等，并且常用于篩查無法診斷的疾病或者結(jié)合患兒病史、家族史考慮存在先天性遺傳性疾病可能的患兒。

2.1 高通量測(cè)序在遺傳代謝性疾病（IMD）中的應(yīng)用IMD是新生兒期常見的一類先天性疾病，是指由于各種因素所致代謝障礙和（或）中間產(chǎn)物堆積引起的一組疾病，臨床表現(xiàn)多樣化且復(fù)雜，發(fā)病時(shí)間早，進(jìn)展迅速，病死率較高，部分疾病早期發(fā)現(xiàn)并加以治療可以有效延緩病情進(jìn)展，因此早期干預(yù)尤為重要。1960年國(guó)外學(xué)者提出進(jìn)行IMD的篩查，由此拉開IMD篩查的序幕。隨著技術(shù)、經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展，篩查項(xiàng)目范圍不斷擴(kuò)大，手段日益豐富，目前針對(duì)IMD高風(fēng)險(xiǎn)患兒氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）檢測(cè)技術(shù)是繼干燥紙片法之后最為常用的手段之一，但也存在漏檢、檢測(cè)結(jié)果與臨床不一定完全匹配等缺點(diǎn)，因此急需挖掘更為準(zhǔn)確的檢測(cè)工具，以便進(jìn)行更有針對(duì)性的治療。近年來，國(guó)內(nèi)多家醫(yī)院和醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)利用高通量測(cè)序輔助IMD患兒的診斷。楊琳等[16]利用Ion Torrent PGM TM平臺(tái)對(duì)1例膽汁酸合成障礙（例1）、1例甲基丙二酸血癥（例2）患兒外周血標(biāo)本進(jìn)行靶向目標(biāo)基因測(cè)序，針對(duì)例1檢測(cè)到相關(guān)HSD3B7基因c.45-46delAG和c.262G＞G/C的復(fù)合雜合突變，以及AMACR 4個(gè)SNP，與多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)和Sanger測(cè)序結(jié)果一致；針對(duì)例2檢測(cè)到相關(guān)MUT基因 c.728-729het-insTT、c.636G＞G/A、c.2011A＞A/G這3個(gè)突變與驗(yàn)證結(jié)果一致。此手段在具有極高靈敏度的同時(shí)又具有以下優(yōu)點(diǎn)：測(cè)序所需時(shí)間較短、成本低；主要由機(jī)器操作，節(jié)省人力；且數(shù)據(jù)分析相對(duì)簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀；不僅包括突變也包括SNP。針對(duì)研究中檢測(cè)到2個(gè)假陽性的現(xiàn)象考慮可能為測(cè)序過程中干擾所致，需要進(jìn)一步提高檢測(cè)技術(shù)水平、數(shù)據(jù)處理和技術(shù)分析能力。郝虎等[17]對(duì)經(jīng)GC-MS/MS檢測(cè)的疑似陽性的10例IMD患兒利用基于目標(biāo)基因的捕獲測(cè)序方法進(jìn)行基因測(cè)序，結(jié)果顯示經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證8例得到確診，其中3例得到準(zhǔn)確分型，這為患方和臨床醫(yī)生提供了精確的基因檢測(cè)結(jié)果，并且為疾病的治療、后期的管理提供了充分的依據(jù)，因此高通量測(cè)序非常適合用于IMD的診斷。IMD也是不斷認(rèn)識(shí)的疾病，雖然目前高通量測(cè)序檢測(cè)到一些尚不能確定為致病突變的變異，但是可以進(jìn)一步研究與疾病的相關(guān)性如嚴(yán)重程度、分型等，可以收入基因庫，作為日后疾病研究的基礎(chǔ)。

韓國(guó)曾對(duì)新生兒疾病篩查結(jié)果呈陽性的269個(gè)患兒進(jìn)行高通量測(cè)序[18]，篩查97個(gè)相關(guān)基因變異情況，20%確診為IMD，值得注意的是，此研究發(fā)現(xiàn)了新的可預(yù)防的IMD患兒，通過早期干預(yù)避免可能出現(xiàn)的嚴(yán)重后果。此研究建立的疾病篩查的模型有助于更快更精確診斷IMD，顯示高通量測(cè)序在篩查中的重要地位。

隨著技術(shù)革新，溶酶體病診斷方法也在逐漸優(yōu)化。高通量測(cè)序的出現(xiàn)彌補(bǔ)了GC-MS/MS、快速干燥紙片采血法的缺陷，有利于診斷疑難病例，揭示常見的基因突變，發(fā)現(xiàn)新的致病基因，擴(kuò)充疾病表型[19]。

研究表明高通量測(cè)序?qū)δ倚岳w維化的診斷具有較高的陽性預(yù)測(cè)值、靈敏度和特異度等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果可以更加有效指導(dǎo)臨床[20-21]。苯丙酮尿癥（PKU）是新生兒較為常見的IMD之一，PAH基因突變最為常見，陳瑛等[22]等運(yùn)用目標(biāo)序列捕獲二代測(cè)序技術(shù)對(duì)PKU患兒進(jìn)行PAH基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有7種錯(cuò)義突變、2種無義突變、3種剪接突變和3種非致病性變異，其中2種為新發(fā)現(xiàn)的可疑致病突變。由于檢測(cè)結(jié)果定位到具體變異位置，明確病因，為基因治療提供依據(jù)[22]。

上述研究表明在IMD的診治中高通量測(cè)序所具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，因而得到廣泛應(yīng)用。

2.2 高通量測(cè)序在先天性畸形中的應(yīng)用 2015年，復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院通過參考以往的數(shù)據(jù)分析及相關(guān)文獻(xiàn)，與美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院合作，結(jié)合實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)建了一套高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程[23]，包括測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理、變異檢測(cè)、變異注釋、變異篩選和變異分類等。他們將理論轉(zhuǎn)化為實(shí)踐，應(yīng)用此流程，對(duì)復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院收治的87例多發(fā)畸形新生兒進(jìn)行WES分析[24]，得到的結(jié)果與目前的結(jié)論一致。對(duì)比貝勒流程，此流程靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均≥96.66%。當(dāng)然由于變異注釋使用的數(shù)據(jù)庫以及設(shè)置的頻率篩選閾值不同，最終結(jié)果與貝勒流程存在一定交叉。這為臨床醫(yī)師如何應(yīng)用高通量測(cè)序進(jìn)行了良好的示范。

2015年，Lim等[25]利用目標(biāo)基因探針捕獲技術(shù)對(duì)15例存在先天性缺陷的患兒進(jìn)行基因檢測(cè)，其中6例檢測(cè)出致病基因，檢出率達(dá)到40.0%；另外5例篩選出候選基因，并正在進(jìn)一步研究中。研究成果表明，針對(duì)有目的性致病基因的患者，此技術(shù)在檢測(cè)成本、分析難度、花費(fèi)時(shí)間等各方面均具有明顯的優(yōu)勢(shì)。Carss等[26]通過對(duì)30例孕婦基因的WES研究發(fā)現(xiàn)，此技術(shù)可以準(zhǔn)確識(shí)別致胎兒畸形的基因突變，可以為孕婦及其家庭提供產(chǎn)前咨詢，不過距離臨床廣泛應(yīng)用還存在一定距離。

新生兒膽汁淤積癥原因眾多，但遺傳性因素是較為常見并且后果嚴(yán)重的病因之一。新生兒膽道閉鎖是常見的膽道先天畸形的一種，主要以肝內(nèi)和肝外膽管進(jìn)行性炎癥和纖維性梗阻為特征，最終導(dǎo)致肝衰竭的疾病，是肝移植的最常見指征[27-28]。2016年，彭小芳等[29]為了分析膽道閉鎖患兒外周血中循環(huán)miRNA的表達(dá)特征，尋求新的疾病診斷標(biāo)志物，對(duì)26例患兒血標(biāo)本提取的miRNA采用Illumina Hiseq測(cè)序，研究結(jié)果全面展示了患兒miRNA的表達(dá)情況，探索異常表達(dá)的miRNA是否可以作為膽道閉鎖無創(chuàng)診斷的參考標(biāo)志物，此方法靈敏度較高，檢測(cè)結(jié)果較常用的芯片技術(shù)精確，并且可以檢測(cè)新的未知的miRNA序列，具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。Alagille綜合征是較為罕見的造成肝內(nèi)膽汁淤積癥的常染色體隱性遺傳病，常為散發(fā)，臨床表現(xiàn)不典型，極易誤診、漏診，且后果嚴(yán)重，目前診斷依賴特征性癥狀、體征。高美玲等[30]利用目標(biāo)基因捕獲4例Alagille綜合征患兒進(jìn)行基因檢測(cè)，結(jié)果不僅得到Sanger測(cè)序驗(yàn)證的肯定，而且確定了JAGl基因致病性突變，其中3例為錯(cuò)義突變 ，e．839C ＞T （P．W280X）、C．703G ＞A（P．R235X）、e．1720C＞T（P．V574M），1 例為插入突變，c．1779-1780insA（p．Ile594AsnfsTer23），經(jīng)家系驗(yàn)證及家族史追蹤，發(fā)現(xiàn)此突變來源于母親，從而可以提供遺傳學(xué)咨詢。上述其中2種突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn)致病突變，意義重大。

2.3 高通量測(cè)序在血液系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用 兒童血液系統(tǒng)疾病較其他系統(tǒng)疾病少見，但通常歸屬于疑難、重癥、易復(fù)發(fā)類，且往往與遺傳性因素有關(guān)。血友病A是常見的凝血異常疾病，目前通過測(cè)定F8因子活性確診，但不能提供遺傳學(xué)信息，也不能檢測(cè)先證者是否存在攜帶，給血友病A患兒家庭帶來極大的困擾。劉安等[31]利用Ion Torrent平臺(tái)對(duì)9例F8因子基因突變的血友病A患兒進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)基因突變具體位點(diǎn)，并對(duì)家系成員進(jìn)行檢測(cè)，其中1例攜帶者孕婦的胎兒產(chǎn)前基因檢測(cè)結(jié)果顯示陰性。

嗜血細(xì)胞性淋巴細(xì)胞增多癥（HLH）進(jìn)展迅速，診斷較難，致死率較高。Tesi等[32]通過對(duì)HLH及正常人群進(jìn)行HLH相關(guān)基因的靶向高通量測(cè)序，為HLH基因診斷提供平臺(tái)，研究結(jié)果有助于解讀基因突變的因果關(guān)系及環(huán)境對(duì)基因突變的影響，但過程復(fù)雜，仍需要進(jìn)一步探索。

一些唐氏綜合征患兒被診斷出有自限性暫時(shí)性骨髓增生異常綜合征（TMD），20%～30%可發(fā)展為急性巨核細(xì)胞性白血?。ˋMKL）。Nikolaev等[33]對(duì) 7例 TMD/AMKL患兒采用WES，同時(shí)所有患兒均進(jìn)行拷貝數(shù)分析，研究顯示所有TMD/AMKL患兒均有GATA1突變。高通量測(cè)序可以在明確致病原因的同時(shí)，為家庭成員提供遺傳咨詢，指導(dǎo)生育。

2.4 高通量測(cè)序在其他遺傳性疾病的應(yīng)用 雖然科學(xué)技術(shù)日益發(fā)達(dá)，但由于基因組的龐大和復(fù)雜，目前有限的醫(yī)療水平尚不能滿足對(duì)疾病的完全認(rèn)識(shí)，還有很大一部分疾病等待人類的發(fā)掘和探索。先天性成骨不全（OI）是罕見的遺傳性疾病，主要表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松、骨脆性增加、藍(lán)眼珠等，不同分型OI，癥狀嚴(yán)重程度不同，其中Ⅱ型較重，但難以確診，且發(fā)病機(jī)制不明。Maasalu等[34]通過檢測(cè)700多個(gè)先證者及其父母基因組DNA序列，闡釋了Ⅱ型OI的致病機(jī)制，分析了基因型與表型之間的關(guān)系，并且發(fā)現(xiàn)了新的可疑致病突變；多發(fā)先天性畸形-肌張力低下-癲癇綜合征1（MCAHS1）是遺傳性糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定缺陷疾病，2011 年首次報(bào)道[35]，GPI廣泛參與機(jī)體各個(gè)生命活動(dòng)，由其引起的疾病表型常常多樣化。胥雨菲等[36]利用靶向目標(biāo)基因測(cè)序?qū)?例MCAHS1患兒進(jìn)行基因測(cè)序，并通過Sanger測(cè)序驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果以及父母攜帶情況，結(jié)果顯示存在PIGN基因的復(fù)合雜合變異，目前國(guó)內(nèi)尚無類似報(bào)道，同時(shí)結(jié)合國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)，總結(jié)了該病的臨床特點(diǎn)、遺傳學(xué)知識(shí)、診治要點(diǎn)等，加深廣大醫(yī)務(wù)工作者對(duì)此疾病的認(rèn)識(shí)。顯示了高通量測(cè)序在某些罕見遺傳性疾病領(lǐng)域研究中的極高價(jià)值。

大多數(shù)弱智兒在新生兒期往往無明顯臨床征象，目前認(rèn)為該病具有遺傳異質(zhì)性。Redin等[37]對(duì)106例智力低下及自閉癥患兒進(jìn)行靶向目標(biāo)基因測(cè)序，分析217個(gè)已知突變與臨床表型的關(guān)系，敏感度達(dá)到25%，并且發(fā)現(xiàn)了新的突變點(diǎn)，闡述了基因型與表型的關(guān)系，這使得我們對(duì)基因變異的認(rèn)識(shí)由軀體疾病擴(kuò)展到心理健康層面。

免疫缺陷病往往和遺傳因素掛鉤，具有明顯的遺傳傾向性，患兒新生兒期常表現(xiàn)為反復(fù)、難控性感染，遠(yuǎn)期影響深遠(yuǎn)。Erman等[38]研究設(shè)計(jì)了HaloPlex探針捕獲方法，對(duì)土耳其19例臨床診斷為重度聯(lián)合免疫缺陷病（SCID）患兒進(jìn)行測(cè)序，此探針涵蓋了356個(gè)原發(fā)性免疫缺陷?。≒ID）以及至少97.3%已知SCID相關(guān)基因，最終發(fā)現(xiàn)可疑致病的8個(gè)突變，檢出率高達(dá)32%。進(jìn)一步研究顯示經(jīng)Sanger測(cè)序確定致病的患兒中，所有已知基因突變均得到驗(yàn)證，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了之前未曾報(bào)道過的可疑突變。共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥（AT）是PID的一種特殊類型，新生兒期可表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞減少等。Mallott等[39]通過高通量測(cè)序方法探索T淋巴細(xì)胞減少有關(guān)的基因突變，發(fā)現(xiàn)與AT基因突變存在一定聯(lián)系。這提示探針捕獲是快速診斷免疫缺陷病基因的手段，同時(shí)可為臨床表型復(fù)雜的患兒提供精準(zhǔn)的基因診斷結(jié)果，有效指導(dǎo)臨床。

長(zhǎng)QT間期綜合征引起的致命性心律失常是兒童猝死的重要原因之一，實(shí)現(xiàn)早期分子診斷有助于評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)，有效改善預(yù)后。Priest等[40]對(duì)10天齡新生兒采用WGS，短時(shí)間內(nèi)找到致病突變來源，可為患兒提供更及時(shí)、可行性更高的診治方案。

此外，新生兒篩查計(jì)劃（NBS）主要目標(biāo)是有針對(duì)性的篩查出高度可預(yù)防或可治療疾病的基因變異，有關(guān)組織提出高通量測(cè)序在NBS中應(yīng)用的可行性、可能存在的問題、需遵循的規(guī)章及注意事項(xiàng)等，為科研學(xué)者、臨床醫(yī)師提供指導(dǎo)[41]。向萍霞等[42]研究表明通過對(duì)孕婦血漿或羊水的胎兒微量DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，可以檢測(cè)胎兒21、18、13號(hào)染色體非整倍體異常，靈敏度達(dá)到100.00%，特異度99.91%。這為胎兒產(chǎn)前無創(chuàng)性檢查提供了新的方法，實(shí)用性較強(qiáng)。

3 展望與挑戰(zhàn)

伴隨著人類基因組計(jì)劃的完成，“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃”的提出，基因測(cè)序技術(shù)應(yīng)時(shí)代要求不斷在發(fā)展。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)是精準(zhǔn)診斷，要想實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診斷，就要求達(dá)到精準(zhǔn)檢測(cè)，而基因檢測(cè)就是其主要手段。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人類基因組完整序列數(shù)據(jù)的獲得所需成本和時(shí)間大大的減少，高通量測(cè)序應(yīng)運(yùn)而生，在實(shí)驗(yàn)室分析研究以及臨床疑難病診治等方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

高通量測(cè)序是近十幾年來新興發(fā)展的新一代基因檢測(cè)技術(shù)，與Sanger測(cè)序方法完全不同，具有測(cè)序速度快、測(cè)序范圍廣、靈敏度高、精確度高、相對(duì)成本低等優(yōu)勢(shì)，隨著技術(shù)的革新，高通量測(cè)序水平逐步走向成熟，越來越多的應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，尤其是遺傳性疾病的診治方面。近年來“二胎政策”的開放使產(chǎn)科、兒科醫(yī)師面臨巨大的挑戰(zhàn)，隨著醫(yī)療水平不斷提高，醫(yī)務(wù)工作者對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)也不斷深入，很多以往診斷不明甚至死亡的病例逐漸被認(rèn)識(shí)，往往其中很大一部分屬于遺傳性疾病，但由于基因的龐大以及檢測(cè)技術(shù)的限制，早期通常難以實(shí)現(xiàn)明確診斷。高通量測(cè)序的出現(xiàn)對(duì)此類疾病來說是非常積極有效的診斷手段。高通量測(cè)序?yàn)橐呻y、危重且高度懷疑遺傳性疾病提供相對(duì)簡(jiǎn)單、精準(zhǔn)的檢測(cè)方法，在明確診斷以及分型的同時(shí)，更有可能發(fā)現(xiàn)新的致病基因，豐富遺傳性疾病基因譜，了解發(fā)病機(jī)制，為治療提供準(zhǔn)確的方向。通過對(duì)其家系成員驗(yàn)證，預(yù)測(cè)患兒父母下一代子女患同樣疾病的風(fēng)險(xiǎn)，提供遺傳咨詢，也在一定程度上避免醫(yī)療糾紛。

雖然高通量測(cè)序具有以上優(yōu)勢(shì)，但也并非“無所不能”和“統(tǒng)一適用”。從適用人群看，針對(duì)那些具有典型臨床表現(xiàn)、候選基因單一的疾病，可以直接選用Sanger檢測(cè)，而高通量測(cè)序?qū)δ切└叨葢岩捎羞z傳性疾病可能、常規(guī)手段不能診斷、需要盡快明確病因的疑難、危重病患者則是非常重要的檢查手段，但是需要與患者家屬進(jìn)行詳細(xì)的溝通和解釋，征得家屬同意。從經(jīng)濟(jì)角度看，相對(duì)其他普通檢測(cè)手段，費(fèi)用偏高，不過隨著技術(shù)革新、經(jīng)濟(jì)水平提高，相信費(fèi)用已不是主要限制因素。從技術(shù)層面看，高通量測(cè)序整個(gè)操作、分析過程相對(duì)復(fù)雜，從DNA提取、制備基因組文庫、PCR擴(kuò)增、不同測(cè)序方法得到測(cè)序數(shù)據(jù)，再進(jìn)行軟件分析、篩選變異、結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析、得出結(jié)論，所需時(shí)間稍長(zhǎng)，一般約4～6周。由于技術(shù)本身測(cè)序原理（除WGS外）為不連續(xù)捕獲、讀長(zhǎng)相對(duì)短等，針對(duì)微小缺失、重復(fù)造成的拷貝數(shù)變異檢測(cè)能力不高。另外不同的平臺(tái)測(cè)序技術(shù)、軟件分析水平也存在差異，可能影響最終結(jié)果，存在假陽性可能，結(jié)果需要一代測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。尤其是生物學(xué)信息分析環(huán)節(jié)，對(duì)技術(shù)員個(gè)人水平要求較高，同樣的測(cè)序結(jié)果，不同分析人員得出結(jié)論可能不同。研究員需要具備豐富的遺傳學(xué)知識(shí)和較高的醫(yī)療技術(shù)水平，實(shí)現(xiàn)理論與臨床實(shí)際的結(jié)合，才能得到最精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果。另一方面，第三代、第四代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，因具有成本更低、讀速更快等優(yōu)點(diǎn)[41]，使得高通量測(cè)序需要不斷自我提升來占有一席之地。總而言之，高通量測(cè)序仍面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

總體來說，就目前的國(guó)情、發(fā)展趨勢(shì)，高通量測(cè)序仍舊是目前兒科遺傳性疾病首選的診斷方法，但由于各種因素影響，要實(shí)行普遍推廣還需要繼續(xù)努力。

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