陳慕芝， 孫學(xué)斌， 巴哈爾古麗·力提甫， 照日格圖， 孫紅艷， 段沐含

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕科， 烏魯木齊 830000； 2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科中心， 烏魯木齊 830054；3新疆醫(yī)科大學(xué)， 烏魯木齊 830011)

原發(fā)性干燥綜合征(primary sjogren′s syndrome,pSS)是一種以進(jìn)行性外分泌腺損傷為特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病，本病發(fā)病機(jī)制至今未明，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的探索一直是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一。microRNAs(miRNAs)是一類在進(jìn)化上高度保守的非編碼、小分子RNA，參與生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、凋亡的調(diào)控及遺傳背景的穩(wěn)定[1]。miRNAs對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞具有多種調(diào)控功能，在固有免疫及適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用，并參與自身免疫病的發(fā)病機(jī)制。Pauley等[2]研究發(fā)現(xiàn)pSS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中miRNA-155 的表達(dá)水平與健康人群相比有顯著差異。pSS屬中醫(yī)學(xué)“燥證”范疇，全國(guó)中醫(yī)痹病專業(yè)委員會(huì)認(rèn)為本病應(yīng)歸屬“燥痹”范疇，其病機(jī)是氣陰兩虛、脾氣虛弱，但在其病機(jī)演變過(guò)程中，亦常兼夾濕熱為患。臨證時(shí)常分氣陰兩虛證、脾氣虛弱證、濕熱浸漬證等辨證論治[3]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-155在pSS患者及健康人PBMC中的表達(dá)水平，并分析pSS氣陰兩虛證與非氣陰兩虛證患者各臨床項(xiàng)指標(biāo)之間的差異，旨在探討miR-155在pSS發(fā)病及疾病進(jìn)展中的意義，并為進(jìn)一步研究pSS患者的發(fā)病特點(diǎn)和中醫(yī)辨證治療提供理論指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2015年3月-2015年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕科就診的pSS患者60例，其中男性2例，女性58例，年齡22～72歲，平均年齡(52.13±11.91)歲。所有pSS患者均符合2002年pSS患者國(guó)際分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，并除外：其他繼發(fā)性干燥綜合征患者，重度心肺功能不全患者，肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病患者，妊娠或哺乳期婦女及精神病患者；重疊其他風(fēng)濕疾病患者。選取同期在本院體檢的健康人30例，其中男性1名，女性29名，年齡22～74(52.24±10.76)歲。pSS患者和健康人在年齡及性別構(gòu)成上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已獲得新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并已獲得所有參與者的知情同意。

1.2方法

1.2.1 分組標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)入選的pSS患者(pSS組)進(jìn)行中醫(yī)辨證分型，選出氣陰兩虛證患者和非氣陰兩虛證患者，各30例，氣陰兩虛證和非氣陰兩虛證患者中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《實(shí)用中醫(yī)風(fēng)濕病學(xué)》[5]診斷標(biāo)準(zhǔn)，以同期在本院體檢的健康人30例為對(duì)照(對(duì)照組)。

1.2.2 主要試劑 EasyPure miRNA Kit購(gòu)于TransGen Biotech公司；TransScript miRNA RT Enzyme Mix購(gòu)于TransGen Biotech公司。

1.2.3 microRNA提取 采集所有受試者空腹外周靜脈血5 mL于EDTA抗凝管中，顛倒混勻數(shù)次，吸取200 μL轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入1 mL LB10，震蕩混勻，室溫孵育5 min。加入200 μL氯仿，劇烈振蕩30 s，室溫孵育3 min，4℃，13 000 rpm離心10 min，轉(zhuǎn)移上層水相至另一新的1.5 mL RNase free離心管，加入1/3體積的無(wú)水乙醇，輕輕顛倒混勻。將上述溶液與沉淀一起加入RNA Spin Column，14 000 rpm室溫離心30 s，收集流出液轉(zhuǎn)入新的1. 5 mL RNase free離心管中，加入1.25倍流出液體積的無(wú)水乙醇，輕輕顛倒混勻。將上述溶液與沉淀一起加miRNA Spin Column 14 000rpm室溫離心30 s，棄掉流出液。加入500 μL WB10，14 000 rpm室溫離心30 s，重復(fù)此步驟1次。室溫14 000 rpm離心2 min，徹底去除殘留的乙醇溶液。將RNA Spin Column放入1.5 mL RNase free離心管中，加入50 μL RNase free water于離心管中央，室溫靜置1 min。室溫14 000 rpm離心1 min，洗脫miRNA后存儲(chǔ)于-80℃冰箱用于反轉(zhuǎn)錄。

1.2.4 microRNA反轉(zhuǎn)錄 按照下列體系配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：miRNA 5.0 μL，TransScript miRNA RT Enzyme MIX 1.0 μL，2×TS miRNA Solution Mix 10.0 μL，RNase Free Water補(bǔ)足至20.0 μL；輕輕混勻后離心10 s，37 ℃孵育 1 h,85℃加熱5 s失活RT Enzyme MIX，迅速置于冰上冷卻，短暫離心置冰上，加水稀釋至100 μL。

1.2.5 PCR反應(yīng) 反轉(zhuǎn)錄CDNA 1.0 μL,Forward primer (10 μM)與Universal miRNA qPCR Primer (10 μM)各0.4 μL，2×TransStart Tip Green qPCR Supermix 10.0 μL，Passive Reference Dye Ⅱ0.4 μL，RNase Free Water補(bǔ)足至20.0 μL。反應(yīng)條件如下：94℃ 30 s 1個(gè)循環(huán)；94℃ 5 s,60℃ 34 s 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。采用公式: 2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量,△Ct=Ct(目的基因)-Ct(U6)，△△Ct=△Ct (實(shí)驗(yàn)樣本) -△Ct (對(duì)照樣本)。

1.2.6 觀察和評(píng)價(jià)指標(biāo) pSS患者miR-155、病程、血沉(ESR)、血小板(PLT)、免疫球蛋白(IgA、IgG)及補(bǔ)體C3、C4。

2結(jié)果

2.1pSS組和對(duì)照組PBMC中miR-155相對(duì)表達(dá)水平的比較pSS組PBMC中miR-155的相對(duì)表達(dá)水平(0.910±0.153)較對(duì)照組(1.024±0.222)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 2.519,P=0.016)。

2.2pSS氣陰兩虛證患者與非氣陰兩虛證患者PBMC中miR-155相對(duì)表達(dá)水平及臨床各項(xiàng)指標(biāo)的比較pSS氣陰兩虛證組患者PBMC中miR-155的相對(duì)表達(dá)水平低于pSS非氣陰兩虛證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；pSS氣陰兩虛證組病程、ESR、PLT、IgA、IgG及補(bǔ)體C3、C4與非氣陰兩虛證組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

3 討論

pSS是一種以淋巴細(xì)胞增殖和進(jìn)行性外分泌腺體損傷為特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病, 臨床上以口干、眼干、瘋狂樣齲齒、反復(fù)腮腺腫大、關(guān)節(jié)痛為主要臨床癥狀。本病起病隱匿，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，病情輕重差異較大，早期診斷、早期治療可有效控制病情進(jìn)展，減少臟器損害[6]，我國(guó)人群患病率為0.3%～0.7%[7]，男女的患病比例為1︰9[8],尤其以45～50歲為多見(jiàn)[9]。本病發(fā)病機(jī)制至今未明，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的探索一直是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

表1 pSS氣陰兩虛證患者與非氣陰兩虛證患者PBMC中miR-155相對(duì)表達(dá)水平及臨床各項(xiàng)指標(biāo)的比較

microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度約22nt的內(nèi)源性非編碼、小分子單鏈RNA，高度保守，廣泛存在于哺乳動(dòng)物、植物、線蟲(chóng)及病毒中，參與生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育和凋亡，其命名規(guī)則為miR-﹟, ﹟為阿拉伯?dāng)?shù)字，高度同源的miRNAs，則在阿拉伯?dāng)?shù)字后面加上小寫字母，如miR-146a、miR-146b等。目前人類基因組已識(shí)別約800個(gè)miRNAs，超過(guò)74%～92%的靶基因受miRNAs的調(diào)控[10]。miRNAs在固有免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞中通過(guò)特定的表達(dá)譜調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，其表達(dá)和功能失調(diào)將導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如癌癥和自身免疫性疾病，近年來(lái)已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在一些自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[11-12]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[13-14]、干燥綜合征[15-16]中存在相應(yīng)的miRNA異常表達(dá)。

miR-155屬于miRNAs家族中的一員, 是一個(gè)典型的多功能miRNA，位于人類21號(hào)染色體上B細(xì)胞非編碼集合基因簇(BIC)的第3個(gè)外顯子中[17]，它在T、B淋巴細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[18], 同時(shí)，miR-155在炎癥介導(dǎo)、抗原提呈、細(xì)胞因子生成的免疫過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[19-20]。鑒于miR-155對(duì)免疫系統(tǒng)的重要調(diào)控作用，有學(xué)者開(kāi)始研究miR-155在自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、pSS、系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的作用。2011年P(guān)auley等[2]報(bào)道在人患者PBMC中miR-155表達(dá)上調(diào)。戚倩如等[21]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比, pSS患者血清中miR-155 的表達(dá)量明顯下調(diào)。本研究結(jié)果顯示,miR-155在pSS患者PBMC中的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，表明miR-155與pSS的發(fā)病有明顯相關(guān)性。但因樣本量較小，尚需擴(kuò)大樣本量以進(jìn)一步明確miR-155在pSS患者中的表達(dá)。

pSS在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中無(wú)病名記載，路志正教授在全國(guó)痹癥專業(yè)委員會(huì)上稱本病為“燥痹”，統(tǒng)一了本病的中醫(yī)病名，使中醫(yī)臨床研究得以廣泛展開(kāi)。路志正教授認(rèn)為本病的根本病機(jī)為氣陰兩虛，臨證時(shí)以氣陰兩虛證為多見(jiàn)[22]。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)126例pSS患者中氣陰兩虛證最多,占80.95%[23]。這與楊佳等[24]的研究報(bào)道一致。本研究結(jié)果顯示，pSS氣陰兩虛證患者PBMC中miR-155的相對(duì)表達(dá)水平低于pSS非氣陰兩虛證患者(P<0.05)；pSS氣陰兩虛證患者的病程較非氣陰兩虛證患者長(zhǎng)、血沉水平較非氣陰兩虛證患者快，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；pSS氣陰兩虛證患者和非氣陰兩虛證患者在PLT、免疫球蛋白IgA、IgG及補(bǔ)體C3、C4等臨床指標(biāo)上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。分析原因可能是與pSS氣陰兩虛證患者病程長(zhǎng)、疾病活動(dòng)度高及病情較重有關(guān)。與中醫(yī)認(rèn)為“久病燥邪入里，耗傷氣陰，損及臟腑，屬于病程后期”相一致，提示miR-155可能可以作為pSS疾病活動(dòng)度的指標(biāo)。

綜上所述，miR-155與pSS的發(fā)病有明顯相關(guān)性，pSS氣陰兩虛證患者PBMC中miR-155表達(dá)下調(diào)，提示miR-155可能可以作為pSS的新型臨床標(biāo)志物及疾病活動(dòng)度的指標(biāo)；但因本研究樣本量較小，尚需擴(kuò)大樣本量以進(jìn)一步研究miR-155在pSS中的具體調(diào)控機(jī)制。

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