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(1. 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室, 無錫 214122; 2. 上海市疾病預(yù)防控制中心, 上海 200336; 3. 雅培營養(yǎng)中國研發(fā)中心, 上海 201203)

維生素A(VA)是視黃醇及其衍生物,如視黃醛、視黃酸、視黃醇乙酸酯、視黃醇棕櫚酸酯等一系列化合物的總稱[1],具有維持視覺等多種生理功能,通常用于防治夜盲癥、干眼病等[1-2]。然而,大量攝入VA會產(chǎn)生副作用,成人的攝入量不超過3 mg·d-1,兒童不能超過2 mg·d-1[3]。維生素E(VE)又名抗不育維生素或生育酚,是生育酚、生育三烯酚及其能夠顯示d-α-生育酚生物活性的衍生物的總稱[4],具有抗不育功能和抗氧化作用[5]。

目前VA和VE的測定通常采用高效液相色譜法(分為反相色譜法和正相色譜法)。反相色譜法通常用堿性乙醇-水溶液對樣品進(jìn)行皂化,水解除去脂肪并將VA和VE從酯的形式分別轉(zhuǎn)化為視黃醇和生育酚的形式[6-21],然后用大量有機溶劑(如石油醚、乙醚或正己烷等)提取皂化后的VA和VE,提取液經(jīng)過水洗、脫水干燥、溶劑蒸發(fā)、吹干和復(fù)溶等實現(xiàn)目標(biāo)化合物的濃縮和溶劑的轉(zhuǎn)換,這些操作和轉(zhuǎn)移不僅降低了工作效率,而且可能造成VA和VE的損失,而且研究表明皂化會對VE造成破壞[22-24]。油脂可以直接進(jìn)入正相色譜[25],因此正相色譜法不需要對樣品進(jìn)行皂化,通常用乙醇[25]或甲醇[26-27]沉淀蛋白后,直接用有機溶劑提取原始形式的VA和VE。與皂化-反相色譜法相比,直接提取-正相色譜法預(yù)處理條件溫和,提取過程簡單方便、工作效率高,可以區(qū)分視黃醇棕櫚酸酯、視黃醇乙酸酯、α-生育酚乙酸酯和α-生育酚等4種化合物。

國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 5009.82-2003[9]和GB 5413.9-2010[10]屬于皂化-反相色譜法,可以較徹底地除去脂類干擾物,適用于食品中VA和VE的測定。國際標(biāo)準(zhǔn)方法AOAC Offcial Method 2012.10[27](AOAC法)屬于直接提取-正相色譜法,是針對目前強化食品中通常添加的視黃醇棕櫚酸酯、視黃醇乙酸酯、α-生育酚乙酸酯和α-生育酚而建立的。國家標(biāo)準(zhǔn)方法預(yù)處理繁瑣冗雜、效率低下;AOAC法簡單方便、工作效率高,可以在嬰幼兒配方食品和成人營養(yǎng)品批量日常檢測中對國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行補充和替代。為了將AOAC法應(yīng)用于日常檢測,有必要對兩種方法進(jìn)行比對,但是目前還沒有相關(guān)的研究。本工作基于現(xiàn)有試驗條件,對國家標(biāo)準(zhǔn)方法和AOAC法進(jìn)行了適用性改變,并比較了兩種方法對多種配方食品的測定結(jié)果。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀,配四元泵、在線真空脫氣機、柱溫箱、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器(DAD)和Chemstation色譜工作站;島津LC 20A型高效液相色譜儀,配低壓四元泵、在線真空脫氣機、柱溫箱、自動進(jìn)樣器、光電二極管陣列檢測器(PDA)和LC solution色譜工作站;普析TU-1950型紫外分光光度計;DK-S16型電熱恒溫水浴鍋;VORTEX-GENIE 2型渦旋振蕩器;IKA RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;IKA KS 501型圓周振蕩搖床;DJ-TDL-50A型臺式低速大容量離心機。

視黃醇、α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:分別稱取視黃醇10 mg、α-生育酚50 mg于100 mL棕色容量瓶中,用乙醇溶解并稀釋至刻度,于-20 ℃保存。并按照GB 5413.9-2010方法進(jìn)行標(biāo)定。

視黃醇棕櫚酸酯、視黃醇乙酸酯、α-生育酚乙酸酯、α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:分別稱取視黃醇棕櫚酸酯20 mg、視黃醇乙酸酯20 mg、α-生育酚乙酸酯40 mg和α-生育酚40 mg于10 mL棕色容量瓶中,用異辛烷溶解并稀釋至刻度,于-20 ℃保存。并按照AOAC Official Method 2012.10進(jìn)行標(biāo)定。

木瓜蛋白酶溶液:20 g·L-1,稱取對苯二酚100 mg和無水乙酸鈉4 g溶解于80 mL水中,用23%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸溶液調(diào)節(jié)其pH至5.0,加入木瓜蛋白酶2 g,溶解后用水定容至100 mL。臨用前配制。

乙醇、甲醇、叔丁基甲醚、正己烷、異辛烷為色譜純;鹽酸、冰乙酸、氫氧化鉀、無水硫酸鈉和無水乙酸鈉為分析純;試驗用水為超純水。

1．2 色譜條件

1) 島津LC 20A型高效液相色譜儀 用Venusil XBP NH2色譜柱(2.1 mm×150 mm,5 μm)代替原方法中的Zorbax NH2色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);柱溫為30 ℃;進(jìn)樣體積為10 μL。在檢測α-生育酚乙酸酯和α-生育酚時用PDA檢測器代替原方法中的熒光檢測器,視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇乙酸酯的檢測波長為325 nm,α-生育酚乙酸酯和α-生育酚的檢測波長為284 nm。流動相:A為正己烷,B為正己烷-叔丁基甲醚(75+25)混合液(含體積分?jǐn)?shù)為0.3%的甲醇作為改良劑)。在原方法的基礎(chǔ)上,通過改變流量和平衡時間得到最終的洗脫程序:0～6.0 min,A為100%,流量為0.15 mL·min-1;6.0～8.0 min,A由100%降為75%,流量保持不變;8.0～8.1 min時,A由75%降為0,流量由0.15 mL·min-1增加至0.5 mL·min-1,并保持6.9 min;15.0～15.1 min時,A由0增加至100%,流量不變,并保持14.9 min。

2) Agilent 1100型高效液相色譜儀 Diamonsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫為35 ℃;流動相為甲醇,等度洗脫;流量1.0 mL·min-1;進(jìn)樣體積為20 μL;α-生育酚和視黃醇的檢測波長分別為292,325 nm。

1．3 試驗方法

1) AOAC法 參考AOAC Offcial Method 2012.10,操作如下:稱取粉末試樣0.50～0.55 g于50 mL離心管中,加入約40 ℃的水5 mL溶解,或移取液態(tài)試樣5.00 mL于50 mL離心管中。向離心管中加入20 g·L-1木瓜蛋白酶溶液5 mL,于(37±2) ℃的水浴中酶解約20 min,4 ℃冷卻約20 min。加入冰乙酸-甲醇(2+98)混合液20 mL,混勻,加入異辛烷10 mL,用機械搖床劇烈振搖提取10 min,以4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液直接進(jìn)樣。整個分析過程要避光。

2) 國家標(biāo)準(zhǔn)方法 參考GB/T 5009.82-2003和GB 5413.9-2010,操作如下:稱取粉末試樣1.00 g或移取液態(tài)試樣10.00 mL于100 mL皂化瓶中,加入無水乙醇30 mL、100 g·L-1維生素C溶液5 mL和500 g·L-1氫氧化鉀溶液10 mL,沸水浴中回流皂化約30 min。皂化液迅速用冷水冷卻,轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中,依次用25 mL水、50 mL石油醚各洗滌皂化瓶兩次后,并入分液漏斗,劇烈振搖提取約1 min,靜置分層,棄去下層水相。石油醚提取液水洗至近中性,用無水硫酸鈉過濾脫水,并轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中,于40 ℃、3×104Pa下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2 mL,氮氣吹干,用2 mL乙醇復(fù)溶,過0.22 μm聚偏氟乙烯(PVDF)濾膜后進(jìn)樣。按照GB 5413.9-2010,采用外標(biāo)法定量。整個分析過程要避光。

2 結(jié)果與討論

2．1 AOAC法檢測器的改變

在測定α-生育酚乙酸酯和α-生育酚時用PDA檢測器代替原方法中的熒光檢測器。由于嬰幼兒配方食品和成人營養(yǎng)品中上述兩種化合物的含量較高,PDA的靈敏度能夠滿足它們的檢測要求。實際樣品中α-生育酚乙酸酯和α-生育酚在190～400 nm下所有波長掃描點的色譜圖見圖1。

由圖1可知:實際樣品中α-生育酚乙酸酯和α-生育酚在190～400 nm下所有波長掃描點的色譜圖形狀對稱、一致,表明改變檢測器后兩種化合物的檢測不受雜峰干擾。

(a) α-生育酚乙酸酯

(b) α-生育酚圖1 樣品中α-生育酚乙酸酯和α-生育酚在190～400 nm下所有波長掃描點的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of α-tocopherol acetate and α-tocopherol in the samples of all wavelength scan points from 190 to 400 nm

2．2 色譜圖

采用AOAC法對視黃醇棕櫚酸酯、視黃醇乙酸酯、α-生育酚乙酸酯、α-生育酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(其中含6.5 mg·L-1視黃醇棕櫚酸酯,2.5 mg·L-1視黃醇乙酸酯,84 mg·L-1α-生育酚乙酸酯,145 mg·L-1α-生育酚)和質(zhì)控樣SRM 1849a(嬰幼兒/成人營養(yǎng)食品標(biāo)準(zhǔn)品)進(jìn)行分析,色譜圖依次見圖2和圖3。

由圖2和圖3可知:VA和VE的4種化合物能夠很好地分離,視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇乙酸酯的13-順式和全反式異構(gòu)體能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離,且4種化合物峰形尖銳、對稱性好。視黃醇棕櫚酸酯在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中只有全反式的異構(gòu)體,在樣品中有13-順式和全反式兩種異構(gòu)體;質(zhì)控樣SRM 1849a中VA只有視黃醇棕櫚酸酯一種化合物,沒有視黃醇乙酸酯。

采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法對視黃醇、α-生育酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(其中含4.75 mg·L-1視黃醇,185 mg·L-1α-生育酚)和質(zhì)控樣SRM 1849a(嬰幼兒/成人營養(yǎng)食品標(biāo)準(zhǔn)品)進(jìn)行分析,色譜圖依次見圖4和圖5。

(a) 325 nm (b) 284 nm2-全反式視黃醇棕櫚酸酯;3-13-順-視黃醇乙酸酯;4-全反式視黃醇乙酸酯;5-α-生育酚乙酸酯;6-α-生育酚圖2 AOAC法分析混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of mixed standard solution with AOAC method

(a) 325 nm (b) 284 nm1-13-順-視黃醇棕櫚酸酯,其余各峰號對應(yīng)的化合物同圖2圖3 AOAC法分析質(zhì)控樣的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of quality control sample with AOAC method

(a) 325 nm (b) 292 nm1-視黃醇;2-α-生育酚圖4 國家標(biāo)準(zhǔn)方法分析混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of mixed standard solution with the GB method

由圖4和圖5可知:皂化后視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇乙酸酯都轉(zhuǎn)化為視黃醇,α-生育酚乙酸酯轉(zhuǎn)化為α-生育酚,沒有雜峰干擾。

2．3 樣品分析

11種市售嬰幼兒配方食品和成人營養(yǎng)品,隨機編為1～11號,除了4,6,8號為液體外其余為固體粉末。

采用AOAC法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法對質(zhì)控樣SRM 1849a和11種嬰幼兒配方食品和成人營養(yǎng)品樣品進(jìn)行分析,其中質(zhì)控樣SRM 1849a平行測定3次。AOAC法測定視黃醇棕櫚酸酯、視黃醇乙酸酯、α-生育酚乙酸酯以及α-生育酚等4種化合物,國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定皂化后的視黃醇和α-生育酚,為了方便比較兩種方法的測定結(jié)果,將VA和VE測定結(jié)果折算為視黃醇和α-生育酚。

(a) 325 nm (b) 292 nm1-視黃醇;2-α-生育酚圖5 國家標(biāo)準(zhǔn)方法分析質(zhì)控樣的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of quality control sample with the GB method

質(zhì)控樣SRM 1849a的分析結(jié)果見表1。

由表1可知:兩種方法都可以準(zhǔn)確測定VA含量,VE的測定值基本處于認(rèn)定值范圍內(nèi),但是AOAC法測定VE更準(zhǔn)確。11種乳粉(液)樣品測定結(jié)果見表2,表2中粉末樣品的測定值單位是mg·kg-1,液體產(chǎn)品測定值的單位是mg·L-1。

表1 質(zhì)控樣SRM 1849a的分析結(jié)果Tab. 1 Analytical results of quality control sample SRM 1849a mg·kg-1

表2 11種樣品的分析結(jié)果Tab. 2 Analytical results of the 11 samples

由表2可知:兩種方法對VA和VE的測定結(jié)果基本是一致的,但是國家標(biāo)準(zhǔn)方法對VE的測定結(jié)果比AOAC法的測定結(jié)果稍低。由試驗結(jié)果還可知:11種樣品中只有一種含有視黃醇乙酸酯,說明配方食品生產(chǎn)中VA的添加形式通常是視黃醇棕櫚酸酯。

2．4 國家標(biāo)準(zhǔn)方法的準(zhǔn)確度試驗

移取適量視黃醇棕櫚酸酯、視黃醇乙酸酯、α-生育酚乙酸酯和α-生育酚的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行皂化處理和測定,其準(zhǔn)確度試驗結(jié)果見表3。

由表3可知:視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇乙酸酯的相對誤差分別為0,1.6%,α-生育酚乙酸酯的相對誤差為-5.1%,α-生育酚的相對誤差為-14%,進(jìn)一步證明了國家標(biāo)準(zhǔn)方法對VE的測定結(jié)果稍微偏低。VE作為天然的抗氧化劑,性質(zhì)不穩(wěn)定、極易氧化破壞,因此對操作過程的保護(hù)要求較高,試驗條件不足,操作不慎均會導(dǎo)致結(jié)果偏低。

表3 國家標(biāo)準(zhǔn)方法的準(zhǔn)確度試驗結(jié)果Tab. 3 Results of test for accuracy of the GB method

本工作通過AOAC法、國家標(biāo)準(zhǔn)方法對質(zhì)控樣SRM 1849a和多種配方食品進(jìn)行分析,從測定結(jié)果可知,AOAC法、國家標(biāo)準(zhǔn)方法對VA和VE的測定結(jié)果基本一致,并且AOAC法對VE的測定更加準(zhǔn)確。AOAC法的預(yù)處理簡單方便、條件溫和、工作效率高。將AOAC法應(yīng)用于嬰幼兒配方食品和成人營養(yǎng)品中VA和VE的日常檢測是切實可行的,但能否實現(xiàn)這一目標(biāo)還需要多實驗室進(jìn)行國家標(biāo)準(zhǔn)方法與AOAC法的比對。

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