王鳳寰，韓 煦，孫 博，趙飛函，溫 賽，杜 鑒，廖永紅

(1.北京工商大學 食品學院 中國輕工業(yè)清潔生產(chǎn)和資源綜合利用重點實驗室，北京 100048；2.中國食品添加劑和配料協(xié)會，北京 100020)

溶菌酶作為一種天然的非特異性抗菌物質(zhì)，廣泛存在于動物、植物和微生物中[1]。溶菌酶通過水解細菌細胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4糖苷鍵而達到殺菌的目的[2]。近年來，隨著細菌耐藥性問題的日益嚴重，對抗生素替代品的研究與開發(fā)已成為眾多科研人員的重要工作之一[3-4]?；谌芫妇哂辛己玫目咕钚砸约拜^好的熱穩(wěn)定性等優(yōu)良特性，溶菌酶現(xiàn)已成功應用于食品防腐、飼料、醫(yī)藥以及化妝品等領(lǐng)域[5-9]。

酒曲是經(jīng)自然培養(yǎng)而成的一種含有多種微生物和酶系的復合糖化發(fā)酵劑。酒曲中微生物的種類和密度對酒的品質(zhì)及風味都有極大的影響[10]。已有研究顯示，在白酒釀造過程中的不同時期，微生物群落組成及豐度是不同的[11]。傳統(tǒng)理論認為，發(fā)酵環(huán)境的變化(如酒醅及酒窖環(huán)境的改變)影響了微生物的生長代謝，導致了微生物群落的變化。

基于本課題組之前的研究[12-14]，筆者提出一種設(shè)想，是否有可能是由于某些菌株在特定時期分泌了溶菌酶，抑制了其他微生物的生長，從而改變了微生物群落的組成和豐度？基于這樣的設(shè)想，筆者對酒曲中的微生物進行了分離、純化，獲得一株產(chǎn)溶菌酶的地衣芽孢桿菌，并用畢赤酵母真核表達系統(tǒng)對其溶菌酶蛋白進行重組表達，以期為進一步實現(xiàn)其工業(yè)化應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和材料

溶壁微球菌、X33菌株、pPICZαA表達載體、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、克雷伯氏菌和酒曲保存于筆者所在實驗室。E.coliTop10感受態(tài)細胞，天根生物公司。pMD19-T克隆載體，TaKaRa公司。

1.1.2 DNA限制性內(nèi)切酶、工具酶和試劑

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ和SacⅠ，NEB公司，T4 DNA連接酶，Thermo公司； 2×Utaq PCR Mix、10×DNA Loading buffer，北京莊盟國際生物基因科技有限公司；DNA Marker和蛋白Marker，寶如億公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒，OMEGA公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生物公司；無氨基酵母氮源(YNB)，Biotopped公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，NaCl 10，酵母浸粉 5；pH 7.0。

若制固體LB培養(yǎng)基，則在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉20 g/L。

孟加拉紅培養(yǎng)基(RBA)(g/L)：蛋白胨 5，KH2PO41，MgSO40.5，葡萄糖10，氯霉素0.1，孟加拉紅0.033，瓊脂18.5。

YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉 10，蛋白胨20，葡萄糖20；若制YPD固體培養(yǎng)基，則加入瓊脂粉 20 g/L。

BMGY培養(yǎng)基：蛋白胨 20 g/L，酵母浸粉 10 g/L，磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)100 mmol/L，無氨基酵母氮源(YNB) 13.4 g/L，生物素4×10-4g/L，甘油1.00%(體積分數(shù))。

BMMY培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L ，酵母浸粉10 g/L，磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)100 mmol/L，YNB 13.4 g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇 1%(體積分數(shù))。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的分離純化

稱取10 g粉碎的酒曲，加入裝有90 mL無菌水和若干玻璃珠的250 mL三角瓶中，置于恒溫搖床中，25 ℃條件下200 r/min振蕩30 s至搖散混勻，使酒曲中微生物均勻分散在無菌水中，記此樣品稀釋度為10-1。然后將此樣品進行10倍梯度稀釋，稀釋至10-6。取10-3、10-4和10-5稀釋液，分別涂布于LB培養(yǎng)基、RBA培養(yǎng)基平板，涂布量為100 μL，每種培養(yǎng)基每個稀釋倍數(shù)各涂布3個平行，待菌液完全吸收后，倒置于37和30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～5 d。根據(jù)菌落生長形態(tài)、大小及顏色的不同，分別挑取不同的單菌落接種于相應的固體培養(yǎng)基中進行純化，直至得到單克隆。之后進行鏡檢，確定是單一菌后進行保菌，存放于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 菌種的液體培養(yǎng)

對分離得到的細菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)16～24 h，對分離得到的酵母在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24～48 h，之后用比濁法檢測發(fā)酵上清液是否具有溶菌酶酶活。

1.2.3 菌種的分子生物學鑒定

對具有溶菌酶酶活的菌株以甘油管的形式進行保菌，存放于-20 ℃冰箱中。將具有酶活的菌株發(fā)酵液由華大基因完成菌種測序鑒定，獲得16S rDNA序列。

1.2.4 溶菌酶基因序列的克隆

在NCBI中找到對應的溶菌酶蛋白所對應的基因序列，設(shè)計帶有酶切位點的特異性引物：Lyz-F(帶有EcoRⅠ酶切位點)和Lyz-R(帶有NotⅠ酶切位點)，以全基因組為模板進行PCR；將PCR產(chǎn)物連接到pMD-19T載體上，轉(zhuǎn)化至E.coliTop10，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，雙酶切驗證，測序。

1.2.5 重組表達質(zhì)粒pPICZαA-Lyz的構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ對克隆載體pMD19-T-Lyz和畢赤酵母表達載體pPICZαA雙酶切，利用T4連接酶將膠回收片段和載體片段連接，轉(zhuǎn)化至E.coliTop 10中，重組質(zhì)粒pPICZαA-Lyz經(jīng)菌落PCR鑒定正確后，搖菌提取質(zhì)粒并測序。

1.2.6 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及高拷貝子的篩選

取10 μL經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacⅠ線性化的重組質(zhì)粒pPICZαA-Lyz與畢赤酵母X33感受態(tài)細胞混勻后加入預冷的0.2 cm的電轉(zhuǎn)杯中，在電壓1.5 kV的電轉(zhuǎn)條件下完成電轉(zhuǎn)化，電擊時間5.2 ms(以表達載體pPICZαA為陰性對照)。分別培養(yǎng)于含較低質(zhì)量濃度Zeocin(100 μg/mL)和較高質(zhì)量濃度Zeocin(500 μg/mL)抗性的YPDS培養(yǎng)基上。在30 ℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)48 h，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.7 重組酵母的誘導表達

將篩選得到的陽性拷貝子及陰性對照酵母菌接種于4 mL YPD培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，在30 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)24 h。按照2.00%(體積分數(shù))的接種量接種于50 mL BMGY培養(yǎng)基中，同等條件下培養(yǎng)至OD600達到5～6。離心收集菌體，用200 mL的BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，每隔24 h補加1次甲醇至終體積分數(shù)為1.00%，30 ℃誘導培養(yǎng)72 h。每隔24 h取樣，離心收集培養(yǎng)液上清。

1.2.8 重組蛋白的分離純化

利用丙酮法沉淀發(fā)酵上清液中的蛋白，用20 mL磷酸緩沖液(PB，pH 7.0，20 mmol/L)溶解蛋白，輕微攪拌均勻后用截留分子量為5 000的透析袋透析48 h，然后用0.22 μm的濾膜過濾透析袋中的蛋白溶液，再用截留分子質(zhì)量為1.0×104的超濾離心管將蛋白溶液濃縮至3 mL左右。將蛋白溶液與1 mL SP-Sepharose Fast Flow column(GE)結(jié)合，以PB為平衡液，磷酸鈉緩沖液(PBS，pH 7.0)在不同濃度(0.3、0.5和1.0 mol/L)下梯度洗脫，收集洗脫蛋白，SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.9 溶菌酶的活性測定

利用比濁法進行溶菌酶活性測定。在25 ℃條件下，以溶壁微球菌為底物，波長450 nm處每分鐘吸光度下降0.001個單位所需的酶量為1個活力單位，酶活性單位為U/mL。在室溫下，迅速向2 mL底物懸液中加入發(fā)酵上清液0.1 mL，記下反應15 s和75 s時波長為450 nm的吸光值(A450)，計算二者差值，即每分鐘吸光度下降數(shù)ΔA450。

1.2.10 重組蛋白的酶學性質(zhì)測定

最適pH的測定：在室溫條件下，測定發(fā)酵上清液在pH 2.0～ 9.0內(nèi)的相對酶活；熱穩(wěn)定性的測定：在最適pH的條件下，將發(fā)酵上清液經(jīng)4、20、40、60、80和100 ℃處理30 min后，檢測發(fā)酵上清液的相對酶活。

1.2.11 溶菌酶的抑菌活性測定

以枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和克雷伯氏菌為測試對象，用紙片法檢測重組畢赤酵母發(fā)酵上清液對4種細菌的抑制活性。將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和克雷伯氏菌分別在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD450達到2～3。將培養(yǎng)液稀釋至10-4后，涂布于LB固體平板上。待菌液涂布均勻被培養(yǎng)基吸收后，用無菌鑷子在平板上放入5片無菌濾紙片(1片在中間，4片在周圍)，中間1片濾紙片作為陰性對照滴加10 μL無菌水，周圍4片濾紙片滴加10 μL發(fā)酵上清液。將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的篩選鑒定

酒曲是白酒發(fā)酵的基礎(chǔ)，在白酒釀造的過程中，微生物種類的更迭也存在周期性變化。在酒曲入酒醅后的釀造過程中，細菌在發(fā)酵前期大量繁殖，其中芽孢桿菌屬細菌屬于優(yōu)勢菌群[15]。從酒曲中分離、純化得到的菌種中，經(jīng)試管培養(yǎng)、比濁法檢測后得到一株具有溶菌酶活性的菌種，命名為FGB1。FGB1經(jīng)LB液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)上清液的酶活為55 U/mL。將華大基因16S rDNA測序結(jié)果與NCBI的GenBank中序列經(jīng)BLAST分析比對后，確定FGB1為地衣芽孢桿菌。

2.2 目的基因的擴增

經(jīng)NCBI查找地衣芽孢桿菌基因組序列后，確定地衣芽孢桿菌中含有一段編碼糖苷水解酶的基因，糖苷水解酶屬于溶菌酶的一種。以地衣芽孢桿菌基因組DNA為模板，利用設(shè)計的特異性引物Lyz-F(5′-TCAGAATTCATGGGAATCAAAGGAATCGAC-3′)和Lyz-R(5′-ATTGCGGCCGCTTATCTAACACGAATTTTC-3′)通過PCR擴增得到目的基因序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.00%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在950 bp左右出現(xiàn)明顯的條帶，如圖1中通道1所示。通道M為DL2000 plus marker。將PCR產(chǎn)物回收后與pMD19-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coliTop10中。經(jīng)藍白斑篩選后，挑取白色單克隆，菌落PCR鑒定其為陽性克隆后，提取重組質(zhì)粒pMD19-T-Lyz。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified lysozyme sequence from Bacillus licheniformis strain

在眾多抗生素替代品中，天然來源的溶菌酶是安全性最高且最具潛力的替代品。近幾年來，國內(nèi)外科研人員先后發(fā)現(xiàn)了來源于人類、哺乳動物以及海洋動物等多種不同的天然溶菌酶，并通過PCR技術(shù)實現(xiàn)了相應溶菌酶目的基因的擴增以及后續(xù)在畢赤酵母中的異源表達[16-19]。對不同來源的溶菌酶同源性進行分析，結(jié)果見表1。由表1可知：從酒曲地衣芽孢桿菌中獲取的溶菌酶，與已克隆表達的溶菌酶相似度最高，為9.12%，表明該溶菌酶具有一定的新穎性。

表1 氨基酸序列同源性分析

2.3 重組表達載體pPICZαA-Lyz的構(gòu)建和驗證

對克隆載體pMD19-T-Lyz和畢赤酵母分泌型表達載體pPICZαA分別進行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切。將純化回收后的目的基因片段和pPICZαA載體片段經(jīng)1.00%瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果見圖2。由圖2可見，通道1和2所示在954和3 500 bp處均有條帶。用T4連接酶將兩部分連接后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTop10中。經(jīng)菌落PCR鑒定，重組表達質(zhì)粒pPICZαA-Lyz構(gòu)建成功。

細菌中天然溶菌酶的產(chǎn)量和活性都非常低，為了提高溶菌酶的表達效果，筆者將地衣芽孢桿菌的溶菌酶基因重組到巴斯德畢赤酵母中。因為畢赤酵母表達系統(tǒng)的pPICZαA表達載體有α信號肽基因，可以使外源蛋白分泌到培養(yǎng)基中，便于后期的分離純化，大幅降低了工業(yè)成本，適用于工業(yè)化生產(chǎn)[20]。

圖2 膠回收產(chǎn)物驗證電泳圖Fig.2 Electrophoresis of gel extraction of pMD19-T-Lyz and pPICZαA

2.4 高拷貝子的篩選

重組表達載體pPICZαA-Lyz轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33菌株后整合于畢赤酵母染色體組中。在100 μg/mL Zeocin平板上篩選得到長勢較好的拷貝子。為進一步提高重組蛋白的表達水平，對重組畢赤酵母進行高拷貝子的篩選。在500 μg/mL Zeocin平板上成功篩選到高拷貝子。用酵母基因組提取試劑盒提取拷貝子的酵母基因組，結(jié)果見圖3。由圖3的菌落PCR鑒定結(jié)果可知，基因被成功重組到畢赤酵母，說明Lyz基因整合到酵母基因組中。

畢赤酵母整合型質(zhì)粒在進行單位交換整合時會以1.00%～10.00% 的幾率發(fā)生重復性整合，由此產(chǎn)生外源基因的多拷貝菌株。而多拷貝菌株往往可以耐受更高質(zhì)量濃度的抗生素，故可通過提高Zeocin的質(zhì)量濃度，嘗試篩選高拷貝子，從而提高重組蛋白的表達水平。

2.5 重組地衣芽孢桿菌溶菌酶的酶活測定

通過比濁法測定陽性拷貝子菌株經(jīng)甲醇誘導24、48和72 h的發(fā)酵上清液中的溶菌酶酶活。搖瓶誘導產(chǎn)酶試驗證實高拷貝菌株在72 h后酶活可達1 360 U/mL。其中，陰性對照菌的酶活為0。

圖5 重組地衣芽孢桿菌溶菌酶酶學性質(zhì)Fig.5 Effects of pH and temperature on the enzyme activity of recombinant lysozyme

2.6 溶菌酶蛋白的分離純化

發(fā)酵上清液經(jīng)丙酮沉淀、透析除鹽、超濾濃縮和陽離子交換柱吸附梯度洗脫后，洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測。梯度洗脫采用濃度分別為0.3、0.5和1.0 mol/L pH 7.0的PBS，每個濃度梯度洗脫體積為10 mL，分別與圖4中通道1、2、3對應。由圖4可以發(fā)現(xiàn)：用濃度為1 mol/L的PBS洗脫的洗脫液在3.5×104左右有一條蛋白條帶，與地衣芽孢桿菌溶菌酶的理論分子質(zhì)量相符，即圖4中第3通道所示條帶，且洗脫液有酶活，第1、2通道的洗脫液無酶活。在分離純化過程中，丙酮沉淀的時間應控制在3 h以內(nèi)，沉淀時間過長會沉淀出過多的雜蛋白，沉淀時間過短會得不到目的蛋白。在丙酮沉淀的過程中，丙酮要預冷處理，避免有機試劑對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的過多損壞。但丙酮法的優(yōu)點是操作簡便省時，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

圖4 SDS-PAGE電泳圖Fig.4 Electrophoresis of SDS-PAGE

2.7 重組蛋白酶學性質(zhì)分析

考察重組蛋白酶的酶學性質(zhì)，結(jié)果見圖5。由圖5可知：在室溫條件下，地衣芽孢桿菌溶菌酶的最適pH為3.0。當pH為2.0時，酶活降為0；當pH為6.0～9.0時，酶活保持穩(wěn)定差別不大。在最適pH 3.0條件下，重組地衣芽孢桿菌溶菌酶具有較好的熱穩(wěn)定性。在4和20 ℃處理30 min后的酶活基本無變化；當溫度為40 ℃時，酶活開始逐漸下降；當溫度為60 ℃時，可保持50%以上的酶活；當溫度為80 ℃時，酶活下降為0。說明地衣芽孢桿菌溶菌酶具有良好的耐酸堿能力以及良好的熱穩(wěn)定性。

2.8 溶菌酶的抑菌活性

枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和克雷伯氏菌在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h后，稀釋度為10-4的培養(yǎng)液涂布效果最好。在稀釋度為10-4的平板上，培養(yǎng)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌，結(jié)果見圖6。由圖6可知：平板出現(xiàn)了比較明顯的抑菌圈；培養(yǎng)大腸桿菌和克雷伯氏菌的平板沒有出現(xiàn)抑菌圈。說明地衣芽孢桿菌溶菌酶可以對革蘭氏陽性菌有比較明顯的抑制效果，但是對革蘭氏陰性菌的抑制效果不明顯。

基于溶菌酶的水解作用機制，溶菌酶可以抑制絕大部分革蘭氏陽性菌的生長，但是對革蘭氏陰性菌的抑制作用卻不明顯。已有研究表明，可以通過對溶菌酶分子進行變性處理、分子改造以及結(jié)合其他防腐劑共同作用的方法提高溶菌酶的抑菌特性，擴大溶菌酶的抑菌范圍[9,21-24]。近幾年，國內(nèi)外研究者針對這一問題，嘗試通過融合兩種不同的溶菌酶基因從而提高溶菌活性和穩(wěn)定性[25-28]。特別地，本研究得到地衣芽孢桿菌溶菌酶對金黃色葡萄球菌具有良好的溶菌作用。金黃色葡萄球菌是一種人類病原菌，能夠引起多種感染。溶菌酶對金黃色葡萄球菌的抑制活性表明它擁有作為食物和飼料防腐劑的應用潛力。

圖6 抑菌圈實驗結(jié)果Fig.6 Antimicrobial activity of recombinant lysozyme

3 結(jié)論

本研究從酒曲中分離純化得到一株產(chǎn)溶菌酶的地衣芽孢桿菌，提取該地衣芽孢桿菌的基因組，設(shè)計特異性引物獲取溶菌酶基因Lyz，構(gòu)建重組表達載體pPICZαA-Lyz，經(jīng)SacⅠ線性化后電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母表達菌株X33中，在Zeocin高抗性平板中篩選出高拷貝轉(zhuǎn)化子。甲醇誘導72 h，通過比濁法測定高拷貝菌株經(jīng)甲醇誘導表達的發(fā)酵上清液，結(jié)果顯示酶活可達1 360 U/mL。將發(fā)酵上清液分離純化后經(jīng)SDS-PAGE分析，在3.5×104處有一條明顯的目的條帶。重組地衣芽孢桿菌溶菌酶可以在pH 3.0～9.0、溫度4～60 ℃的范圍內(nèi)保持足夠的活力，具有良好的耐酸堿性和熱穩(wěn)定性，為進一步研究其抗菌應用、實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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