趙文斌+歐陽曉勇+鄭喜

摘要：目的觀察中藥祛斑合劑對D-半乳糖所致衰老模型小鼠皮膚相關(guān)指標(biāo)的影響。方法健康昆明種小鼠60只，隨機分為正常對照組、衰老模型組、祛斑合劑高、中、低劑量（12.0.6.0，3.0 mL/kg）組和維生素E組（陽性對照組），每組10只。衰老模型組、制劑高、中、低劑量組和維生素E組，頸背部皮下注射5%D-半乳糖連續(xù)6w，建立小鼠亞急性衰老模型。給藥組同時灌胃給予祛斑合劑和維生素E，正常對照組和衰老模型組給予等體積純凈水。檢測皮膚組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）、脂褐質(zhì)（Lpf）、羥脯氨酸（Hyp）含量及皮膚水分含量。結(jié)果祛斑合劑可提高皮膚SOD活力，提高Hyp含量及皮膚水分含量；降低皮膚MDA及Lpf含量。結(jié)論祛斑合劑具有抗D-半乳糖所致小鼠皮膚衰老的作用。

關(guān)鍵詞：中藥祛斑合劑；抗皮膚衰老；抗氧化；動物實驗

中圖分類號：R85.5文獻標(biāo)志碼：B文章編號：1007-2349（2018）01-0075-02

皮膚是人體最大的器官，是美容的主要對象。皮膚老化常表現(xiàn)為皮膚干燥、粗糙、脫屑、色斑、松弛、皺紋、皮膚萎縮、血管突顯、敏感性和脆性增加等[1]。它不僅影響美觀，還與脂溢性角化、基底細胞癌等多種皮膚病有著病因?qū)W的聯(lián)系。因此預(yù)防和延緩皮膚衰老一直是近些年醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的熱點之一。本院皮膚科已故專家（國家級名老中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承指導(dǎo)老師、云南省名老中醫(yī)）劉復(fù)興教授經(jīng)驗方中藥祛斑合劑（院內(nèi)制劑），多年來臨床應(yīng)用于防治黃褐斑、皮膚老化，取得較好療效。筆者采用中藥祛斑合劑對抗小鼠皮膚衰老做了實驗研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物及材料清潔級健康昆明種小鼠，體重18-22 g，雌雄各半，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，中藥祛斑合劑由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、脂褐質(zhì)Lpf試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、羥脯氨酸（Hyp）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；D-半乳糖（上海藍季科技發(fā)展有限公司）；維生素E（浙江醫(yī)藥有限公司）；其余試劑為市售分析純。 751光柵分光光度計，RF.540熒光分光光度計，MEGAFUGE 1.0R高速臺式離心機。

1.2實驗方法[2-3]

1.2.1動物模型制備、分組、給藥及取材選擇清潔級健康昆明種小鼠60只，體重（20±2）g，雌雄不限，隨機分成6組，每組10只，雌雄分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為18～22℃，相對濕度為45%～55%，規(guī)律光照，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 W后開始實驗。隨機分為正常對照組、衰老模型組、中藥祛斑合劑高、中、低劑量組和維生素E組（陽性對照組），每組10只，分籠飼養(yǎng)。衰老模型組、制劑高、中、低劑量組和維生素E組，每日經(jīng)頸背部皮下注射5%D-半乳糖25 mL/kg，建立小鼠亞急性衰老模型[4]，正常對照組每日經(jīng)頸背部皮下注射等體積的生理鹽水。同時祛斑合劑各組每日灌胃給予祛斑合劑（高12.0、中6.0、低3.0 mL/kg）；維生素E組每日灌胃給予維生素E 500 mg/kg；正常對照組和衰老模型組每日灌胃給予等體積純凈水，各組均連續(xù)給藥6 W。第7周處死動物前1 d，所有動物兩肩胛至兩髂骨之間背部皮膚以10%Na2S溶液對稱脫毛（面積為3 cm×3 cm）；第2天處死動物，取背部正中皮膚0.5 cm×0.5 cm大小，留取1 g待測含水量用，其余迅速冰凍保存，擬作皮膚組織勻漿及測定皮膚羥脯氨酸等指標(biāo)之用，各指標(biāo)所選取材部位相同。實驗過程中，每5 d各鼠稱重記錄1次，每日觀察小鼠的皮毛色澤、飲食、飲水、大小便、精神活動情況等。

1.2.210%皮膚勻漿的制備取脫毛皮膚組織0.5 g，經(jīng)預(yù)冷生理鹽水漂洗，除去皮下脂肪和其他結(jié)締組織，濾紙拭干，稱重，量筒量取該組織塊9倍質(zhì)量預(yù)冷生理鹽水，用勻漿機制成10%組織勻漿（在低溫環(huán)境中使組織細胞完全破碎，顯微鏡下觀察內(nèi)容物全部游離在液相中）。

1.2.3各項指標(biāo)的測定皮膚勻漿中Lpf，SOD，MDA.Hyp含量或活力，均根據(jù)測試盒所附方法、步驟測定。

1.2.4皮膚中水分含量的測定采用烘干法取1 g皮膚，精密稱取濕重后置烘箱中，于80℃烘干12 h，稱其干重，計算皮膚含水量。

2結(jié)果

中藥祛斑合劑能提高衰老模型小鼠皮膚超氧化物歧化酶（SOD）活力及羥脯氨酸（Hyp）含量和皮膚含水量；降低衰老模型小鼠皮膚組織中脂褐質(zhì)（Lpf）、丙二醛（MDA）含量，且呈現(xiàn)劑量依賴性。提示本品具有延緩皮膚衰老作用（表1）。

3討論

皮膚的衰老是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，對此有多種解釋，如自由基學(xué)說、交聯(lián)學(xué)說、遺傳學(xué)說、免疫學(xué)說等，其中自由基學(xué)說比較被認同。機體在新陳代謝過程中，不斷產(chǎn)生自由基，自由基攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、核酸、多聚不飽和脂肪酸等，使其交聯(lián)或斷裂，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，形成過氧化脂質(zhì)，后者與膜脂和膜蛋白聚合，交聯(lián)形成脂褐質(zhì)沉積于組織中，在皮膚上形成色斑；自由基堆積還可使具有合成膠原能力的成纖維細胞受損，細胞內(nèi)羥化酶失去羥化功能，羥脯氨酸的生成減少，膠原蛋白合成減少，導(dǎo)致皮膚皺紋形成、皮膚松弛[5-6]。

SOD是體內(nèi)最重要的自由基清除劑，是唯一能特異性清除衰老啟動因子O2-的抗氧化酶，提高SOD活性可抑制脂褐質(zhì)的沉積[7]。MDA的水平可反應(yīng)活性氧的損傷效應(yīng)[8]。皮膚組織中水分含量以及SOD活力和MDA、Hyp、Lpf含量是判定受試動物皮膚衰老程度的重要指標(biāo)。研究已證明D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老模型是可靠的衰老實驗動物模型。因此，本課題采用D-半乳糖造成小鼠皮膚亞急性衰老模型[9]。

本實驗結(jié)果表明，中藥祛斑合劑能提高衰老小鼠皮膚中水分含量、羥脯氨酸（Hyp）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力，降低衰老小鼠皮膚組織中脂褐質(zhì)（Lpf）、丙二醛（MDA）含量。表明中藥祛斑合劑具有一定的延緩皮膚衰老的功效。其作用機制可能是通過提高SOD活性，增強機體抗氧化能力即增強清除自由基的能力，進而抑制自由基反應(yīng)，從而抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA以及Lpf的生成和積聚，減輕了對成纖維細胞和膠原蛋白的損害。endprint

中醫(yī)理論認為[10-11]皮膚衰老以及整個機體衰老的直接原因是五臟虛損、氣血失調(diào)所致的正氣不足。正氣虛則皮膚不能得到充分的濡養(yǎng)滋潤，防御能力下降，易受外邪的侵襲。且外邪侵襲日久，邪氣盛則正氣虛，可見臟腑功能低下，氣血乏源，脈絡(luò)瘀阻，肌膚甲錯，老相叢生。故正虛邪實是皮膚衰老的主要病理機制。因此，中醫(yī)延緩皮膚衰老的主要特點就是從五臟氣血論治，即側(cè)重于通過滋補五臟、調(diào)理氣血、疏通經(jīng)絡(luò)等措施來延緩皮膚衰老。

本院皮膚科已故專家劉復(fù)興教授是國家級名老中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承指導(dǎo)老師、云南省名老中醫(yī)，學(xué)術(shù)思想精深，臨床經(jīng)驗豐富，擅于皮膚疾病的診治，我院根據(jù)其臨床經(jīng)驗研制的院內(nèi)制劑祛斑合劑（主要成分：女貞子、旱蓮草、玉竹、白芍、丹參、柴胡、玫瑰花等），具有滋補肝腎、疏肝解郁、化瘀祛斑之功效。多年來臨床應(yīng)用于防治黃褐斑、皮膚老化，取得較好療效。本研究通過動物實驗初步揭示其延緩皮膚衰老的作用機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2017-10-16）endprint