腫瘤血管生成擬態(tài)形成的機(jī)制

歐潔，王順超，吳紅艷*

（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院1免疫系，2感染與炎癥損傷研究所，宜昌443002）

血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）是腫瘤組織供血的重要方式，在侵襲性腫瘤中普遍增加，并與腫瘤發(fā)展程度和患者生存預(yù)后差相關(guān)[1,2]。腫瘤誘導(dǎo)VM形成給當(dāng)今抗腫瘤治療帶來(lái)較多困難，因此，研究腫瘤VM形成機(jī)制也是腫瘤防治研究的重要領(lǐng)域。在此，本文簡(jiǎn)要總結(jié)近三年腫瘤促使VM形成機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 VM的基本特征

VM外觀(guān)為一種相互連接的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，分為實(shí)質(zhì)性結(jié)構(gòu)和管腔樣結(jié)構(gòu)[3,4]；管腔結(jié)構(gòu)富含基質(zhì)，內(nèi)腔為單層癌細(xì)胞和分泌性糖蛋白覆蓋（例如蛋白聚糖和糖蛋白樣層粘連蛋白等）；實(shí)質(zhì)性結(jié)構(gòu)主要為基質(zhì)包裹的癌細(xì)胞。因其不含內(nèi)皮細(xì)胞，VM主要通過(guò)高碘酸-希夫（periodic acid-schiff，PAS）染色[5]陽(yáng)性來(lái)鑒定。VM主要在腫瘤缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、腫瘤形成初期和侵襲的過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞受異常信號(hào)調(diào)節(jié)極化形成，當(dāng)然目前的研究也證明腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）等[3,4,6-8]也參與VM的組成；由于能夠形成VM的腫瘤細(xì)胞共同表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞和干細(xì)胞以及腫瘤標(biāo)志物，并且成血管相關(guān)細(xì)胞參與VM原始結(jié)構(gòu)的形成[6,9-10]，VM可能為血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的前體形式。此外，VM具有類(lèi)似于血管的血液灌注能力，該能力于2017年由Racordon[4]等成功建立的無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞方式體外替代性灌注途徑[4]明確證實(shí)。但是基于PAS陽(yáng)性也存在于無(wú)灌注能力的實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)，研究者使用PAS典型標(biāo)志物作為檢測(cè)VM的存在而斷定其功能是存在爭(zhēng)議的。但是，它們是否能在異常刺激下轉(zhuǎn)化為管腔樣的結(jié)構(gòu)還有待確認(rèn)。

2 腫瘤中VM形成的相關(guān)機(jī)制

2.1 腫瘤細(xì)胞特異性

VM的形成可能因不同機(jī)制的調(diào)節(jié)而存在細(xì)胞特異性，比如營(yíng)養(yǎng)缺乏和生長(zhǎng)因子缺乏可誘導(dǎo)三陰性乳腺癌中以間充質(zhì)細(xì)胞系為主的MDAMB-231細(xì)胞系、BT-549細(xì)胞系、Hs578T細(xì)胞系和SUM159PT細(xì)胞系形成VM，并且表現(xiàn)出MDAMB-231細(xì)胞系和BT-549細(xì)胞系中CD44hi/CD24low表型的細(xì)胞比例增加，因此推測(cè)存在與VM相關(guān)的干細(xì)胞樣群體；而相對(duì)的三陰性乳腺癌的其他細(xì)胞系卻不能被誘導(dǎo)形成VM，表現(xiàn)出VM相關(guān)信號(hào)受體表達(dá)較低[8]。此外，Min Su[11]的實(shí)驗(yàn)證明體外低濃度人體絨（毛）膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）能促使OVCAR-3細(xì)胞系形成VM并穩(wěn)定表達(dá)HCG受體，而SKOV-3細(xì)胞系即使在高濃度的HCG刺激下也不能形成VM。但是，在Racordon[4]體外構(gòu)建的VM模型中，無(wú)明顯刺激的情況下SKOV-3細(xì)胞系卻可以形成VM，而OVCAR-3細(xì)胞系卻不具備這種能力；再者，他們首次證明腫瘤轉(zhuǎn)移的細(xì)胞團(tuán)塊可以通過(guò)腫瘤原代培養(yǎng)物的輔助獲得形成VM的能力（比如腫瘤引起的腹水），由此推測(cè)形成VM的能力不是某一種細(xì)胞系所特有，或者通過(guò)細(xì)胞系衍生來(lái)解釋等。實(shí)質(zhì)上這種現(xiàn)象目前還處于比較片面的理解狀態(tài)，大多只是描述某種機(jī)制下某種細(xì)胞具有形成VM的能力，還缺乏全面的研究證明某種細(xì)胞在不同的條件之間如何轉(zhuǎn)換通路而獲得形成VM的能力。

2.2 促使VM形成的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制

2.2.1 MMPs

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）與腫瘤進(jìn)展程度普遍存在正相關(guān)性，作為VM中出現(xiàn)的典型分子，其參與多種機(jī)制促進(jìn)VM的形成。比如惡性膠質(zhì)瘤中，MMP-2切割Ln-5成105kD的Ln-5c2’和80kD的Ln-5c2x片段，或者在VM形成的信號(hào)傳導(dǎo)最后階段，MMP-14的表達(dá)和活化將proMMP-2轉(zhuǎn)化為活性MMP-2，兩者結(jié)合促使層粘連蛋白5g2鏈被切割成g20和g2x片段等，通過(guò)以上這些片段增加表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和肌動(dòng)蛋白絲的表達(dá)引起細(xì)胞骨架重組和運(yùn)動(dòng)等促進(jìn)VM的形成[7,12]。另外，MMP-2與表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）共同作用也能輔助于抗腫瘤藥物停用之后的腫瘤侵襲能力的恢復(fù)和增加，以及VM的形成[13]，但是其機(jī)制還不清楚。此外，MMP-9和MMP-7等在促使VM的形成中也起到一定的作用[7]。因此，VM的形成對(duì)MMPs有一定的依賴(lài)性，MMPs也可能成為抗VM形成的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.2.2 HIF-1α 和HIF-2α

HIF-1α是由缺氧的腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)表達(dá)并參與VM形成的一個(gè)重要信號(hào)分子。HIF-1α與腫瘤中VM的密度呈正相關(guān)性，并影響腫瘤的進(jìn)展和患者預(yù)后。W Li[14]等人首次應(yīng)用VM陽(yáng)性的結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）細(xì)胞模型證明CRC中EMT、HIF-1α和VM之間的相關(guān)性。其關(guān)系為缺氧環(huán)境引起HIF-1α表達(dá)增加，HIF-1α促使EMT相關(guān)的緊密連接蛋白4（claudin-4）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vim）等的相關(guān)基因表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)EMT；EMT作為VM形成的基礎(chǔ)促進(jìn)VM的形成，并且兩者之間存在協(xié)同作用[14]。隨后，在肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中發(fā)現(xiàn)賴(lài)氨酰氧化酶2（lysyl oxidases like 2， LOXL2）是HIF-1α調(diào)節(jié)EMT和VM之間關(guān)系的必需物質(zhì)。HIF-1α誘導(dǎo)LOXL2蛋白表達(dá)，LOXL2促使E-cadherin的丟失和波形蛋白表達(dá)的上調(diào)，從而促進(jìn)VM形成。就此，在基因檢測(cè)分析中發(fā)現(xiàn)LOXL2的相關(guān)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）中解螺旋酶轉(zhuǎn)錄因子（helicase like transcription factor, HLTF）、CENPF、異常紡錘體樣小頭畸形相關(guān)蛋白（abnormal spindle-like microcephaly-associated protein, ASPM）、NIPBL（nipped-B-like, NIPBL）、絲氨酸/蘇氨酸激酶20樣激酶（STE20 like kinase，SLK）、磷脂酰肌醇-4-磷酸3-激酶C2結(jié)構(gòu)域的α多肽（Phosphatidylinositol-4-phosphate 3-kinase C2 domain-containing alpha polypeptide ，PIK3C2A）、染色體維持蛋白2（structural maintenance of chromosomes 2，SMC2）、TATA-盒結(jié)合蛋白相關(guān)因子9b（TATA-box binding protein associated factor 9b，TAF9B）和三磷酸腺苷酶家族蛋白2（ATPase family, AAA domain containing 2，ATAD2）的表達(dá)明顯升高[15]。因此，LOXL2可能通過(guò)以上DEGS促使VM的形成，但是其中的精細(xì)分子通路還不清楚。再者，HIF-1α可能參與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子neuritin 1在體外和體內(nèi)的過(guò)表達(dá)，并可能通過(guò)與其配體的相互作用促使VM的形成[6]；或參與驅(qū)動(dòng)HCG的過(guò)度表達(dá)以及作為巨噬細(xì)胞參與體內(nèi)VM形成的關(guān)鍵因子（有利于巨噬細(xì)胞形成VM的初始和具有灌注功能網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)）[9,11,16]等。因此HIF-1α是缺氧環(huán)境中誘導(dǎo)VM形成不可或缺的重要分子。值得注意的是，HIF-1α參與腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞形成VM的現(xiàn)象可能暗示HIF-1α參與腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞在腫瘤中募集的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)。

另外，在胰腺癌患者中可以檢測(cè)到VM陽(yáng)性腫瘤的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核高表達(dá)HIF-2α，增加的HIF-2α通過(guò)上調(diào)扭曲轉(zhuǎn)錄因子（twist-related protein 1，twist1）的表達(dá)，之后twist1的P1（-421bp）和P4（-2110bp）結(jié)合序列與VE-鈣黏蛋白（VE-cadherin）啟動(dòng)子的結(jié)合增加VE-cadherin的表達(dá)，VE-cadherin作為VM的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，能通過(guò)調(diào)節(jié)凱索依賴(lài)性基因表達(dá)促進(jìn)VM形成[17,18]。同時(shí)，HIF-2α的表達(dá)伴隨MMP-2和MMP-9的表達(dá)增加，彼此可能具有協(xié)同作用。當(dāng)然，這其中也可能涉及到MMP-14的參與。

2.2.3 HCG

VM具有HCG濃度依賴(lài)性。Min Su[11]等人在應(yīng)用卵巢癌研究VM的實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建缺氧條件并使用不同濃度的HCG處理OVCAR-3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著HCG濃度的增加VM的密度增加，并且該作用在5000mU/ml的HCG濃度下誘導(dǎo)效果最佳。隨后，在SAINAN GAO[19]的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)增加絨毛膜促性腺激素β多肽5（CGB5）（它是β-HCG的第五個(gè)亞基并被鑒定為HCG的關(guān)鍵部分）可以增加上皮卵巢癌中的VM，并伴隨著CGB5的受體（黃體生成素受體）表達(dá)增加。因此，HCG也有可能通過(guò)與其下游受體通路作用促成VM，但是具體途徑和機(jī)制還不清楚。

2.2.4 lncRNA

多種長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA），如轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄物1（MALAT1）和LINC00339等在腫瘤中高表達(dá)，通過(guò)誘導(dǎo)促VM形成的相關(guān)蛋白表達(dá)，或者和miRNA之間共同作用等促進(jìn)VM的形成，并與腫瘤分期呈正相關(guān)性。比如在胃癌中MALAT1的過(guò)度表達(dá)增加VE-cadherin、β-連環(huán)蛋白、MMP-14、MMP-2和MMP-9的表達(dá)，并通過(guò)細(xì)胞外調(diào)節(jié)的MAP激酶（extracellular regulated MAP kinase ，ERK）/MMP和黏附激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)/樁蛋白（paxillin）信號(hào)通路的作用等[20]共同誘導(dǎo)VM的形成。而在惡性膠質(zhì)瘤中，過(guò)表達(dá)的LINC00339和lncRNA HOXA簇反義RNA2（HOXA-AS2）與miRNA作用誘導(dǎo)VM的形成。LINC00339與miR-539-5p結(jié)合而下調(diào)miR-539-5p并增加twist1的表達(dá)，twist1結(jié)合MMP-2和MMP-14的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)一步誘導(dǎo)它們的表達(dá)[21]；另外，HOXA-AS2的過(guò)度表達(dá)增加miR-373的表達(dá)，并通過(guò)miR-373增加EGFR活性，進(jìn)而激活PI3K/AKT、增加VE-cadherin、MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性[7]。由此看出，lncRNA在基因水平上調(diào)節(jié)VM的形成具有關(guān)鍵而廣泛的作用。

2.2.5 腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞

腫瘤能招募腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞[16]，如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumour-associated macrophages，TAM），并通過(guò)它們促使VM的形成。TAM通過(guò)環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）激活誘導(dǎo)多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的VM形成[6]。在多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，巨噬細(xì)胞在VM陽(yáng)性區(qū)域浸潤(rùn)增加，通過(guò)高度表達(dá)COX-2激活前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）/假 定 蛋 白 質(zhì) 1（hypothetical protein 1，EP1）/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）途徑促使VM形成，因此COX-2可能是VM的必需物質(zhì)。在該機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)VM相關(guān)的TAM表現(xiàn)為M2型，并高度表達(dá)CD68和CD206；再者，用IL-4激活的TAM表現(xiàn)出CD68、Arg-1和CD204的m-RNA水平顯著增加[6]。這些表現(xiàn)可能與腫瘤VM局部微環(huán)境的刺激有關(guān)。另外，有研究證明TAM形成VM的初始結(jié)構(gòu)必需HIF-1α的參與[9]，但是其機(jī)制尚不清楚。而在食管癌中，CD66b +腫瘤浸潤(rùn)性嗜中性粒細(xì)胞（tumor-infiltrating neutrophil，TIN）通過(guò)自身和腫瘤細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的相互作用誘導(dǎo)VM形成。這其中的機(jī)制可能是在腫瘤微環(huán)境中招募的TIN誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT而起作用[22]。但讓人好奇的是在肝癌中發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞旁分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）能誘導(dǎo)VM形成[23]，這其中的機(jī)制可能涉及到分泌TGF-β的相關(guān)免疫細(xì)胞與腫瘤的相互作用，也可能隱藏著其它促腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞通過(guò)彼此之間的聯(lián)系促進(jìn)VM形成的重要機(jī)制。

2.2.6 自分泌信號(hào)傳導(dǎo)通路

EM Langer[8]等人在研究抑制鋅指E盒結(jié)合同源框1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）的miRNA對(duì)VM的形成抑制時(shí)發(fā)現(xiàn)在Claudin-low癌細(xì)胞系中VM的形成涉及自分泌信號(hào)傳導(dǎo)通路。自分泌信號(hào)傳導(dǎo)通路響應(yīng)于營(yíng)養(yǎng)缺乏而促進(jìn)VM的形成，其主要機(jī)制為通過(guò)高表達(dá)自分泌信號(hào)傳導(dǎo)因子纖連蛋白1（fibronectin 1 ，F(xiàn)N1）和絲氨酸蛋白酶抑制劑（絲氨酸蛋白酶）家族E成員2 [serine protease inhibitor (serpin) family E member 2，SERPINE2]，以及其受體整合素β1（integrin beta 1，ITGB1）和低密度受體相關(guān)蛋白（low-density lipoprotein recepor-related protein 1，LRP1）等。FN1和SERPINE2通過(guò)與細(xì)胞表面受體ITGB1和LRP1相互作用響應(yīng)于營(yíng)養(yǎng)缺乏而誘導(dǎo)VM形成。而SERPINE2能誘導(dǎo)細(xì)胞的自分泌功能，因此該機(jī)制可能存在自身放大的效應(yīng)而增加對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏的響應(yīng)。另外，該實(shí)驗(yàn)首次證明抑制ZEB1的miR-200c所引起的白細(xì)胞蛋白酶抑制因子（secretory leukocyte peptidase inhibitor，SLPI）、趨化因子（C-X-C基序）配體1[chemokine (C-X-C motif) ligand 1，CXCL1]或白細(xì)胞介素8對(duì)形成VM的細(xì)胞內(nèi)在和自分泌信號(hào)的調(diào)節(jié)無(wú)顯著貢獻(xiàn)，否定了之前的相關(guān)報(bào)道結(jié)果。當(dāng)然，這種差異是否由于實(shí)驗(yàn)條件的影響，還有待進(jìn)一步證實(shí)。

2.2.7 細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶5

細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶5（cyclin dependent like kinase 5，CDK5）通過(guò)FAK/蛋白激酶B（protein Kinase B，AKT）信號(hào)傳導(dǎo)途徑控制非小細(xì)胞肺癌中的血管生成擬態(tài)形成[24]。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)CDK5調(diào)節(jié)FAKSer732和AKTSer472磷酸化水平，并通過(guò)FAK引起緊湊和定向的纖維狀F-肌動(dòng)蛋白排列致使細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化促進(jìn)VM的形成。并在體內(nèi)和體外應(yīng)用CDK5的抑制劑證實(shí)CDK5抑制能有效抑制VM的形成。然而，關(guān)于CDK促進(jìn)VM形成的機(jī)制了解甚少，其中的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

2.2.8 其他

二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1（recombinant dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1，DDAH1）在乳腺癌中促進(jìn)VM，以及DDAH1的3’UTR是miR-193b的直接靶標(biāo)之間的相互關(guān)系[25]。在VM陽(yáng)性的腫瘤中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)MIG-7 mRNA的高表達(dá)，而VE-cadherin表達(dá)與MIG-7mRNA之間存在正相關(guān)性。MIG-7在腫瘤組織中的高表達(dá)以及VE-cadherin的高表達(dá)可能具有促進(jìn)VM形成的協(xié)同作用[26]。再者，CD147[27]、水通道蛋白-1[28]、幾丁質(zhì)酶3[29]、Dickkopf-1[30]、瘦素[31]和高遷移率族蛋白A2[32]等在腫瘤中促進(jìn)VM的形成等。但是其中許多只是在臨床患者標(biāo)本中觀(guān)察到相關(guān)的現(xiàn)象，其中的機(jī)制還不清楚。

3 問(wèn)題與展望

本文綜述近年腫瘤促進(jìn)VM形成的部分研究進(jìn)展。但關(guān)于VM形成機(jī)制的研究還沒(méi)有完全闡明，比如缺氧環(huán)境誘導(dǎo)的相應(yīng)信號(hào)（比如HIF-1α和HIF-2α等）所起的調(diào)控作用復(fù)雜而廣泛，涉及到蛋白、激素和免疫細(xì)胞等，由于缺氧是腫瘤微環(huán)境中最常見(jiàn)的現(xiàn)象之一，進(jìn)一步研究精細(xì)調(diào)控通路是有必要的。再者，腫瘤通過(guò)何種機(jī)制促使lncRNA的過(guò)表達(dá)，lncRNA與miRNA之間促進(jìn)VM形成存在怎樣的機(jī)制，鑒于lncRNA調(diào)節(jié)信號(hào)的多樣性，lncRNA與其他信號(hào)通路之間是否還存在聯(lián)絡(luò)等還有待研究；而更加值得注意的是，腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞在VM形成中的作用?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)證明腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的免疫抑制促進(jìn)腫瘤發(fā)展[33]，如何尋找兩者之間的相關(guān)性存在一定的研究應(yīng)用價(jià)值等。雖然目前也有針對(duì)抑制VM的研究包括應(yīng)用通過(guò)納米技術(shù)遞送抗腫瘤藥物或基因[34]和應(yīng)用中草藥抑制VM的相關(guān)信號(hào)[23]等的研究取得了一定的效果，但是其中也發(fā)現(xiàn)抑制VM的抗腫瘤藥物會(huì)引起腫瘤耐藥性。該如何結(jié)合藥物和調(diào)控耐藥之間的關(guān)系以達(dá)到抑制VM的形成還遺留著諸多問(wèn)題待解決。然而，針對(duì)于VM的促腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的作用，有效阻斷VM的形成在防治和抗腫瘤形成中可能會(huì)起到關(guān)鍵性作用，具有重要的潛在研究?jī)r(jià)值。