陳浩浩，鄭群，王文倩，江文嬌，王飛鳳，傅曉艷，張寧*

（1金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；2金華市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心；3 金華市思丹姆干細(xì)胞生物科技有限公司，金華321000）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是多能的干細(xì)胞，可以分化形成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞[1-3]。 MSC可以從骨髓、脂肪、臍帶血、臍帶和羊膜等多種組織分離。人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSc）具有便于取材、來(lái)源廣泛、細(xì)胞增殖快、分化能力強(qiáng)的特點(diǎn)，適合進(jìn)行體外擴(kuò)充增殖，且無(wú)倫理學(xué)限制，是一個(gè)有潛力的MSC來(lái)源。間充質(zhì)干細(xì)胞已被用于動(dòng)物模型和臨床實(shí)驗(yàn)以治療許多疾病，如心肌梗塞，移植物抗宿主病，中風(fēng)和脊髓損傷[4]。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，對(duì)中樞神經(jīng)和周?chē)窠?jīng)生長(zhǎng)、發(fā)育及分化至關(guān)重要[5]。NGF通常在成體海馬和皮質(zhì)表達(dá)，并提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持膽堿能神經(jīng)元[6]。重組β-NGF蛋白進(jìn)入受損神經(jīng)中可促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和增強(qiáng)神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)，但在體內(nèi)NGF半衰期較短，不會(huì)穿過(guò)血腦屏障并難以輸送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)[7]。通過(guò)對(duì)UMSCs進(jìn)行基因修飾，讓其過(guò)表達(dá)NGF，進(jìn)入體內(nèi)后能修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，促進(jìn)神經(jīng)元的存活或再生，因此本研究對(duì)慢病毒介導(dǎo)NGF過(guò)表達(dá)對(duì)體外UMSCs分化的影響進(jìn)行了探討。

材料和方法

1 材料

本研究所用臍帶組織為健康產(chǎn)婦自愿捐贈(zèng)，由金華市思丹姆干細(xì)胞生物科技有限公司提供；DMEM、胎牛血清（FBS）、胰酶、青鏈霉素等均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CD34、CD45、CD19、CD14、CD105、CD90、CD73熒光素偶聯(lián)抗體購(gòu)自BD公司；NGF、GAPDH抗體及二抗購(gòu)自Abcam；β-NGF ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物公司；BIORAD逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自杭州寶誠(chéng)生物；引物由上海生工合成。

2 NGF過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建

通過(guò)Pubmed檢索Human ngf mRNA序列為XM_006710663.3，長(zhǎng)度為 943bp，https∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_006710663.3，采用pLVX.CMV. eGFP. PGK. PuroR載體，元件順序?yàn)?FLAGNGF-GFP，委托杭州赫貝生物技術(shù)公司構(gòu)建合成，最終得到滴度為1×108TU/ml的病毒顆粒。

3 UCMSc分離培養(yǎng)及鑒定

取臍帶組織，用PBS液清洗組織3遍，用眼科剪刀將組織標(biāo)本剪碎；將臍帶轉(zhuǎn)移至細(xì)胞分離管中，加入2ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEN-F12+10%胎牛血清+1%青鏈霉素）后，組織分離器攪拌3次（每次45s）。然后將組織轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中加入適量PBS，300g離心15min，棄上清，再加入PBS重復(fù)洗滌3次，加培養(yǎng)液，置于37oС、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上，收集細(xì)胞并傳代，傳至第3代時(shí)，收集細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀察細(xì)胞表面分子CD34、CD45、CD19、CD14、CD105、CD90、CD73的表達(dá)。

4 慢病毒轉(zhuǎn)染

對(duì)鑒定后的細(xì)胞傳代擴(kuò)增，收集細(xì)胞，配成5×105cells/ml細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，4h后換液，棄去部分培養(yǎng)基，加MOI值10的病毒液及8ng/ml Polybrene，其中轉(zhuǎn)染組為攜帶NGF，對(duì)照組只攜帶GFP，培養(yǎng)6h后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5 免疫熒光

將細(xì)胞接種于放有小圓蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞快長(zhǎng)滿(mǎn)玻片時(shí)，吸出上清，4%多聚甲醛固定，抗體封閉液37 ℃1h，加兔抗NGF抗體（1∶200）4℃過(guò)夜，PBS洗3次，TRITC標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶50）37 ℃溫育1h，PBS洗3次，加DAPI染色液（10 ng/ml），抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察。

6 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液NGF含量

收集細(xì)胞相應(yīng)培養(yǎng)液上清，BCA法檢測(cè)各樣本總蛋白濃度。采用Human β-NGF ELISA 檢測(cè)試劑盒，參照試劑盒內(nèi)步驟進(jìn)行，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)讀取OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算各樣本NGF含量（pg/ml），最終結(jié)果以NGF含量和總蛋白濃度的比值表示，即每mg蛋白中NGF的含量（pg/mg）。

7 Western blot

收集細(xì)胞加入蛋白裂解液100μl，裂解10min，4℃、12000g離心5min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取等量蛋白，加5×SDS loading buffer沸水浴變性5min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，80V，30min，直至所有樣品壓成一線(xiàn)，120V 100min；冰盒轉(zhuǎn)膜，200mA，60min；5%脫脂奶粉室溫封閉60min；兔抗 NGF（1∶1000）、小鼠抗 GAPDH（1∶1000）4℃孵育過(guò)夜；TBST洗3次，每次10min；HRP標(biāo)記山羊抗兔（1∶5000）、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠（1∶5000）37℃孵育1h；TBST洗3次，每次10min；ECL A液+B液5min，顯影液3min，定影液3min；拍照。應(yīng)用Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶光密度進(jìn)行測(cè)定，以NGF與GAPDH條帶光密度比值表示NGF相對(duì)表達(dá)水平。

8 qRT-PCR

收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，取2μl RNA酶標(biāo)儀測(cè)定RNA溶液濃度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，管中加入4μl 5×iScript Reaction Mix、1μl iScript Reverse Transcriptase、1μg RNA 以 及 RNase free ddH2O 至20μl。在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：25℃ 5min，46℃ 20min，95℃ 1min。取反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA各2μl作為模板，分別 10μmol/L 引物 1μl（引物序列見(jiàn)表1），2×iTaqTMuniversal SYBR@Green supermix 10μl，ddH2O 7μl，95℃ 5s， 60℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)，PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣品的Ct值從內(nèi)參基因的值中減去得到ΔCt，然后比較2-ΔΔCt值。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s) 表示，對(duì)數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布和方差齊性的兩組間數(shù)據(jù)分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，多組間數(shù)據(jù)分析采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異。

表1 qRT-PCR引物序列Tab. 1 Sequences of primers for qRT-PCR

結(jié) 果

1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

圖1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞。A，CD34（PE）和CD45（FITC）都陰性；B，CD14（APC）陰性而CD73（PE）陽(yáng)性；C，CD19（APC）陰性而CD105（PE）陽(yáng)性；D，CD90（FITC）陽(yáng)性Fig. 1 Identification of mesenchymal stem cells by flow cytometry. A, CD34 (PE) and CD45 (FITC) were negative; B, CD14 (APC) was negative and CD73 (PE) was positive; C, CD19 (APC) was negative and CD105 (PE) was positive; D, CD90 (FITC) was positive

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，分離的細(xì)胞其表面標(biāo)記CD34（PE）和CD45（FITC）都為陰性（圖1A），CD14（APC）為陰性而CD73（PE）為陽(yáng)性（圖1B），CD19（APC）為陰性而CD105（PE）為陽(yáng)性（圖1C），CD90（FITC）為陽(yáng)性（圖1D），據(jù)此認(rèn)定為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

2 NGF基因修飾的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)和分泌NGF

免疫熒光染色檢測(cè)顯示，過(guò)表達(dá)NGF的慢病毒轉(zhuǎn)染72h后，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)GFP（綠色）的同時(shí)有NGF表達(dá)（TRITC標(biāo)記，紅色）（圖2）。

Western blot和qRT-PCR檢測(cè)顯示，過(guò)表達(dá)NGF的慢病毒轉(zhuǎn)染的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中NGF的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組和空白組（圖3A和圖3B）。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)NGF的慢病毒轉(zhuǎn)染的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞β-NGF含量為（747.61±208.74）pg/mg，顯著高于對(duì)照組的（1.48±0.57）pg/mg和空白組的（2.04±0.29）pg/mg（圖3C）。

由此表明，過(guò)表達(dá)NGF的慢病毒轉(zhuǎn)染成功，NGF基因修飾的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高水平表達(dá)和分泌 β-NGF。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中NGF的免疫熒光檢測(cè)。A，表達(dá)GFP（綠色）的細(xì)胞；B，與A同一視野中的免疫熒光染色顯示的表達(dá)NGF的細(xì)胞（TRITC標(biāo)記，紅色）；C，同視野內(nèi)DAPI染色的細(xì)胞核（藍(lán)色）；D，A、B和C的疊加圖像；比例尺，20μmFig. 2 Immunofluorescence assay for NGF expression in umbilical cord mesenchymal stem cells transfected with NGF-lentivirus. A, cells expressing GFP (green); B, cells expressing NGF stained by immunofluorescence (TRITC conjugated, red) in the same field as A; C, the nuclei stained by DAPI(blue) in the same field as A; D, the merged image of A, B and C; scale bar, 20μm

3 NGF基因修飾的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)nestin、GFAP、MAP2、tubulin mRNA

對(duì)神經(jīng)譜系的特異性標(biāo)志物mRNA進(jìn)行qRTPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組和空白組，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的nestin、GFAP、MAP2、tubulin mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖4）。

討 論

NGF對(duì)于神經(jīng)元（特別是感覺(jué)神經(jīng)元）的生長(zhǎng)和發(fā)育是非常重要的，其分子量大約為13.2kDa，所以不能有效通過(guò)血腦屏障，即使進(jìn)入腦內(nèi)也很快降解，需要持續(xù)給藥維持效果。另外由于人體內(nèi)廣泛存在NGF受體（神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子p75和酪氨酸激酶A），易出現(xiàn)明顯副作用，因而限制了NGF的臨床應(yīng)用[8,9]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用MSCs （mesenchymal stem cells）治療一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，證實(shí)了其具有一定的療效[10,11]。有研究發(fā)現(xiàn)采用VEGF和GDNF等基因修飾的MSCs移植治療某些疾病的效果要優(yōu)于單純應(yīng)用MSCs治療[12]，而間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)因子（如NGF）的作用下可分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞[13,14]。這些結(jié)果給予了我們啟發(fā)，在本研究中，我們利用重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染UCMSc，通過(guò)神經(jīng)譜系的特定基因的檢測(cè)證實(shí)UCMSc能分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。

圖3 慢病毒轉(zhuǎn)染的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞NGF表達(dá)與分泌檢測(cè)。A，NGF表達(dá)的Western blot檢測(cè)：A1，代表性Western blot結(jié)果；A2，NGF表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；B，NGF mRNA表達(dá)水平qRT-PCR檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C，細(xì)胞上清液β-NGF含量ELISA法檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)分析；**P＜0.01（n=3）Fig. 3 Detection for expression and secretion of NGF in umbilical cord mesenchymal stem cells transfected with NGF-lentivirus. A, Western blot detection for NGF expression∶ A1, representative Western blot results; A2, statistical analysis for NGF expression level; B, statistical analysis of NGF mRNA expression detected by qRT-PCR; C, statistical analysis of β-NGF content in cell supernatants detected by ELISA; **P＜0.01 (n=3)

圖4 qRT-PCR檢測(cè)nestin、GFAP、MAP2及tubulin mRNA表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與對(duì)照組比較：*0.01＜P＜0.05（n=3）Fig. 4 Statistical analysis of mRNA expression levels of nestin, GFAP,MAP2 and tubulin detected by qRT-PCR; compared with control group∶*0.01＜P＜0.05 (n=3)

NGF主要由α、β和γ三種亞單位，而β亞單位是具有NGF的生物活性單位，在我們的研究中，對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)液中的β-NGF測(cè)定顯示，轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)液中β-NGF的含量明顯升高，表明轉(zhuǎn)染后的UCMSc開(kāi)始大量分泌NGF。收集細(xì)胞利用Western blot和qRT-PCR檢測(cè)則證明了NGF內(nèi)源性表達(dá)增多。Nestin、GFAP、MAP2及tubulin等神經(jīng)特異性蛋白在神經(jīng)干細(xì)胞分化和增殖中起決定性作用[15]，因而我們對(duì)細(xì)胞的神經(jīng)譜系的特異性標(biāo)志物進(jìn)行了基因水平表達(dá)的檢測(cè)，結(jié)果顯示這些標(biāo)志物在基因?qū)用姹磉_(dá)都有顯著性增加，這說(shuō)明慢病毒介導(dǎo)的NGF過(guò)表達(dá)能促進(jìn)UCMSc向神經(jīng)元樣細(xì)胞進(jìn)行分化。而目前對(duì)于MSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化這一現(xiàn)象是由內(nèi)源性表達(dá)引起，還是培養(yǎng)液中高濃度NGF引起，還不明確。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)NGF后4d，細(xì)胞內(nèi)源性NGF水平反而出現(xiàn)降低[16]，這與我們的結(jié)果不太一致，可能原因首先為MSC來(lái)源不同，本研究采用P3代UCMSc，其次慢病毒轉(zhuǎn)染后會(huì)影響MSc的增殖傳代，從而可能會(huì)影響NGF的表達(dá)。國(guó)內(nèi)學(xué)者證實(shí)鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子能夠體外誘導(dǎo)UCMSc分化為類(lèi)神經(jīng)元，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞GFAP陽(yáng)性率高于NSE陽(yáng)性率，表明UCMSc更多轉(zhuǎn)換為了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[17]。因此，UCMSc向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的相關(guān)機(jī)理仍需要科研人員進(jìn)一步深入的研究。

本研究得到的轉(zhuǎn)染NGF臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能以自分泌的形式獲得穩(wěn)定持久的NGF表達(dá)，不僅自身能向神經(jīng)元樣分化，若應(yīng)用于一些神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ缂顾钃p傷、老年癡呆、多發(fā)性硬化癥等）的治療，也能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，從而保護(hù)受損的神經(jīng)元免于死亡，并誘導(dǎo)神經(jīng)纖維再生。我們認(rèn)為將干細(xì)胞和NGF的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)能力聯(lián)合應(yīng)用可能是比較一種有前景的治療途徑。