病理快速冷凍切片染色的質(zhì)控切片制備

張翠霞，方慶全*，陳世東

（1廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科；2廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廈門 361003）

冷凍切片是快速將組織冷凍成一定的硬度、切出薄片的過程[1]。隨著對術(shù)中冷凍切片的深入研究，目前術(shù)中冷凍切片已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病理診斷中[2-3]。病理冷凍切片制作質(zhì)量的好壞，會影響病理醫(yī)生的診斷準(zhǔn)確性。在有限的時間內(nèi)又快又好地完成冷凍切片的制片，不僅是病理診斷的需要，更是術(shù)中外科醫(yī)師的迫切要求[4]。近年來，隨著各種檢測技術(shù)不斷實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化，全自動染色機(jī)已逐漸應(yīng)用于快速冷凍切片HE染色中，而病理技術(shù)工作者面臨著如何對冷凍切片染色機(jī)內(nèi)的染液進(jìn)行質(zhì)控的難題。以往全自動染色機(jī)應(yīng)用于組織脫水處理后的常規(guī)HE切片的染色時，只需將常規(guī)HE切片放進(jìn)染色機(jī)內(nèi)，依照染色結(jié)果對機(jī)內(nèi)的染色液進(jìn)行調(diào)整。冷凍切片的染色液種類及其流程與常規(guī)HE切片染色無異，但兩者的染色時間顯著不同，常規(guī)HE切片不能用于冷凍切片染色程序染液的質(zhì)控。冷凍切片制片過程中，如果染液未做好質(zhì)控，冷凍切片染色效果不佳時，再來調(diào)整染色機(jī)內(nèi)染液，重新進(jìn)行冷凍切片與染色就將顯著延長冷凍切片出片時間，嚴(yán)重影響病理診斷及時率并拖延手術(shù)的等待時間。故筆者通過實(shí)驗(yàn)，旨在探索一種較佳的冷凍切片HE染色染液質(zhì)控方法。

材料與方法

1 材料

隨機(jī)抽取2017年9月至2017年12月廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科的快速冷凍切片標(biāo)本60例，其中甲狀腺組織20例，乳腺組織20例及肺組織20例?；颊咝詣e及年齡無限制。

2 主要設(shè)備

LEICA CM1950冷凍切片機(jī)（德國萊卡）；DAKEWE（達(dá)科為）全自動染色機(jī)。

3 主要試劑

包埋劑，AAF液(由95%乙醇A：乙酸A：甲醛 F = 85∶5∶10 組成 )，新鮮配制的 Harri蘇木素染液，1%鹽酸乙醇液，飽和碳酸鋰溶液，0.5%酸化伊紅，75%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，無水乙醇。

4 取材

新鮮送檢組織取材大小約為1.5cm×1.5cm×0.3cm，每一個病例取2塊組織，隨機(jī)分為A、B兩組（每組60塊），所有組織塊切取后均立即放置于冷凍切片機(jī)托頭上，加適量的包埋劑，將托頭連同組織放置于已預(yù)先設(shè)置至-25℃的凍臺上速凍。

5 冷凍切片的制作

為保證實(shí)驗(yàn)更加準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)切片的制作都采用新刀片。

5.1 A組切片制備

A組組織用冷凍切片機(jī)各切取一張厚度為5～6μm的冷凍切片，立即放入AAF液固定30s，然后置于染液已經(jīng)質(zhì)控的DAKEWE全自動染色機(jī)內(nèi)進(jìn)行HE染色：水洗5s→新鮮配制的Harri蘇木素染液90s→自來水沖洗15s→ 1%鹽酸乙醇液1s→自來水沖洗1s→飽和碳酸鋰溶液4s→自來水沖洗15s→0.5%酸化伊紅2s→自來水沖洗15s→ 75%乙醇2s→85%乙醇2s→ 95%乙醇1s→無水乙醇1s，染色結(jié)束后吹干，中性樹膠封片。

5.2 B組切片制備

B組組織用冷凍切片機(jī)各切取一張厚度為5～6μm的冷凍切片，立即放入AAF液固定30s，隨后取出，室溫晾干后再次放進(jìn)冷凍切片機(jī)機(jī)箱內(nèi)，第二天上午8點(diǎn)取出，然后置于DAKEWE全自動染色機(jī)內(nèi)進(jìn)行染色，染色方法同A組。

5.3 C組切片制備

得到A組切片后的組織，不做任何處理，直接放置于冷凍切片機(jī)機(jī)箱內(nèi)，調(diào)節(jié)冷凍切片機(jī)箱溫至-10℃直至第二天上午8點(diǎn)，再將冷凍切片機(jī)凍臺設(shè)置至-25℃、夾頭溫度設(shè)置至-17℃后，用冷凍切片機(jī)再各切取一張厚度為5～6μm的冷凍切片，立即放入AAF液固定30s，然后置于染液已經(jīng)質(zhì)控的DAKEWE全自動染色機(jī)內(nèi)進(jìn)行染色，染色方法同A組。

5.4 D組切片制備

得到B組切片后的組織，于組織上加適量包埋劑覆蓋后，放冷凍切片機(jī)機(jī)箱內(nèi)，其余操作同C組。

6 冷凍切片質(zhì)量觀察指標(biāo)

切片質(zhì)量評價：觀察切片的組織裂隙、皺褶和冰晶，以10分制評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：若切片的組織無裂隙、無皺褶、無冰晶，則每項(xiàng)指標(biāo)得分均為10分；若切片上X%面積的組織出現(xiàn)相應(yīng)的指標(biāo)，則該指標(biāo)得分為10-X/10。例如，某切片上25%面積的組織有裂隙，則該切片裂隙指標(biāo)得分為10-25/10=7.5分。以此類推。

染色效果評價：觀察各組切片染色后組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核著色和核質(zhì)對比清晰度，以10分制評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：若切片組織結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞核鮮艷、核質(zhì)對比清晰，則每項(xiàng)指標(biāo)得分均為10分；若切片組織結(jié)構(gòu)輕度模糊，尚不影響觀察，減1～2分；組織結(jié)構(gòu)模糊，一定程度的影響觀察，減3～6分；組織結(jié)構(gòu)模糊不清，嚴(yán)重影響觀察，減7～10分。2名高級質(zhì)控師進(jìn)行雙盲評片，每項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)為評分的均值。結(jié)果采用表示。

7 全自動染色機(jī)染液質(zhì)控方法

選取待染冷凍切片放入全自動染色機(jī)內(nèi)進(jìn)行HE染色，染色完成后，鏡下觀察切片染色質(zhì)量，染色效果好（組織結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞核鮮艷、核質(zhì)對比清晰）則無需對染液進(jìn)行更換或調(diào)整染色時間，可直接進(jìn)行后續(xù)的快速冷凍切片染色；若鏡下觀察切片染色質(zhì)量差，則需針對染色結(jié)果，進(jìn)行相應(yīng)的染液更換或調(diào)整染液染色時間，再進(jìn)行一次質(zhì)控測試，直至測試結(jié)果顯示染色效果好為止。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示。將 B、C、D 3組冷凍切片的切片質(zhì)量與染色效果各項(xiàng)指標(biāo)分別與A組進(jìn)行比較，2組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 冷凍切片切片質(zhì)量的比較

不同制備方法所制冷凍切片無裂隙、無皺褶、無冰晶指標(biāo)得分情況見表1。A、B兩組切片的裂隙、皺褶、冰晶指標(biāo)得分比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；C組切片裂隙指標(biāo)得分低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；D組切片后組織冰晶指標(biāo)得分低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。A組染色片（圖1A）無裂隙、無皺褶、無冰晶；B組染色片（圖1B）無裂隙、無皺褶、無冰晶；C組染色片（圖1C）有裂隙、無皺褶、無冰晶；D組染色片（圖1D）無裂隙、無皺褶、有冰晶。

表1 4組冷凍切片質(zhì)量評價得分Tab. 1 4 groups of frozen sections quality evaluation scores

2 冷凍切片染色效果的比較

4組冷凍切片染色效果評分結(jié)果顯示，B、C 2組組織結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞核鮮艷、核質(zhì)對比清晰指標(biāo)得分分別與A組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；D組組織結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞核鮮艷、核質(zhì)對比清晰指標(biāo)得分均分別低于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組染色片（圖1A）組織結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞核鮮艷、核質(zhì)對比清晰；B組染色片（圖1B）組織結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞核鮮艷、核質(zhì)對比清晰；C組染色片（圖1C）組織結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞核鮮艷、核質(zhì)對比清晰；D組染色片（圖1D）組織結(jié)構(gòu)欠清晰、細(xì)胞核不鮮艷、核質(zhì)對比不清晰。

表2 4組冷凍切片染色效果評分結(jié)果Tab. 2 4 groups of frozen sections staining effect score

討 論

快速冷凍切片主要用于病理醫(yī)師對臨床手術(shù)病人在術(shù)中的快速病理診斷，是確定某些“低風(fēng)險”病理參數(shù)的一般可靠工具[5]，方便外科手術(shù)醫(yī)師在此基礎(chǔ)上決定手術(shù)方案、范圍及治療方法，故為了能更好、更快地將病理快速冷凍報告發(fā)給臨床手術(shù)醫(yī)師，快速制作一張質(zhì)量好的冷凍切片至關(guān)重要。

作者實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)手工染色方法比較，全自動染色機(jī)應(yīng)用于病理科的快速冷凍切片HE染色具有以下優(yōu)勢：① HE染色質(zhì)量穩(wěn)定。②省時省力。單片染色耗時上，全自動染色機(jī)與傳統(tǒng)手工染色相比無明顯差異，但前者能同時進(jìn)行大批量染色，而且節(jié)省人力[6]，技術(shù)人員可進(jìn)行下一臺快速冷凍的制片。③安全環(huán)保。全自動染色機(jī)在密閉的空間內(nèi)完成染色操作，大大減少了試劑的揮發(fā)性刺激，同時也減輕對工作人員的化學(xué)危害及環(huán)境的污染[7]。

日常冷凍切片進(jìn)行全自動HE染色過程中，我們常遇到如下問題：①未進(jìn)行冷凍切片染色前，染色機(jī)內(nèi)染液的染色能力不能預(yù)知。②更換冷凍切片染色機(jī)內(nèi)的蘇木素、分化液、返藍(lán)液或伊紅等染液后，如果沒有進(jìn)行試染，其染色效果未知。③調(diào)整冷凍切片染色機(jī)內(nèi)染液的染色時間后，如果沒有進(jìn)行試染，其染色效果未知。以上三個問題任何一個未處理好，將有可能使得染出來的冷凍切片染色效果不佳，而此時再來調(diào)整染色機(jī)內(nèi)染液，重新進(jìn)行冷凍切片與染色就將大大延長冷凍切片出片時間。有了質(zhì)量可靠的冷凍切片待染片，在每天臨床需進(jìn)行快速冷凍切片的組織送至病理科前，病理技術(shù)工作者有充裕的時間將冷凍切片待染片放入全自動染色機(jī)內(nèi)進(jìn)行HE染色，通過鏡下觀察冷凍切片染色質(zhì)量。當(dāng)出現(xiàn)冷凍切片染色質(zhì)量差的問題，如組織結(jié)構(gòu)不清晰、細(xì)胞核暗灰或核質(zhì)對比不清晰，則對蘇木素、分化液，反藍(lán)液或伊紅染液進(jìn)行相應(yīng)的更換，或者對相應(yīng)染液的染色時間進(jìn)行調(diào)整。調(diào)整后再進(jìn)行一次質(zhì)控測試，若測試結(jié)果滿意，則質(zhì)控工作完成；若仍有染色質(zhì)量問題，則再進(jìn)行下一次質(zhì)控測試，直至測試結(jié)果顯示染色效果好為止。因此，制作質(zhì)量可靠的病理冷凍切片預(yù)染片至關(guān)重要。

圖1 4組冷凍切片HE染色（同一患者甲狀腺和肺組織）。A組切片無裂隙，無皺褶，無冰晶，組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核鮮艷，核質(zhì)對比清晰；B組切片無裂隙，無皺褶，無冰晶，組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核鮮艷，核質(zhì)對比清晰；C組切片有裂隙（箭頭所示），無皺褶，無冰晶，組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核鮮艷，核質(zhì)對比清晰；D組切片無裂隙，無皺褶，有冰晶（箭頭所示），組織結(jié)構(gòu)欠清，細(xì)胞核染色欠佳，核質(zhì)對比欠清；比例尺，100μmFig. 1 HE staining of frozen sections in 4 groups (thyroid and lung tissues of the same patient). Group A, it showed no crack, no wrinkles, no ice crystals,clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm; group B, it showed no crack, no wrinkles, no ice crystals, clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm; group C, it showed crack (indicated by the arrow), no wrinkles, no ice crystals, clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm; group D, it showed no crack, no wrinkles, ice crystals(indicated by the arrows), unclear tissue structure, no bright nucleus, and unclear contrast between nucleus and cytoplasm; scale bar, 100μm

為了探索一種較佳的病理冷凍切片染色質(zhì)控片，作者通過對比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，B組實(shí)驗(yàn)得到的冷凍切片經(jīng)過HE染色后，切片質(zhì)量及染色效果均與A組（標(biāo)準(zhǔn)組）相當(dāng)，且優(yōu)于C、D組。B組實(shí)驗(yàn)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：①質(zhì)量可靠；②簡便易行；③通過保障病理冷凍切片質(zhì)量，避免患者在手術(shù)臺上花過多時間等待病理冷凍切片報告，減少并發(fā)癥；④通過質(zhì)控，進(jìn)一步探索全自動染色機(jī)染多少片后需進(jìn)行染液調(diào)換，或幾天后染液衰退需進(jìn)行更換，以逐漸達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)驗(yàn)過程中，筆者發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)缺乏室間質(zhì)控這一缺點(diǎn)，我院病理科作為該市的病理質(zhì)控中心，還需不懈努力，進(jìn)一步推進(jìn)這一工作。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，冷凍后的組織塊，如果表面裸露，經(jīng)過冷凍過夜，組織表面干燥，組織容易出現(xiàn)裂隙，尤其以甲狀腺等細(xì)胞成分極為豐富的組織或肺等甚為疏松的組織更為顯著，但組織染色效果并不受影響。冷凍組織表面裸露后再加包埋劑后，再置于冷凍切片機(jī)內(nèi)冷凍，其切片較平整，裂隙及皺褶少，但冰晶較明顯，組織染色質(zhì)量下降，尤其以疏松組織為甚，筆者認(rèn)為這可能是冷凍組織被包埋劑復(fù)溫溶化，再次被冷凍切片機(jī)的凍臺冷凍，當(dāng)細(xì)胞外液開始結(jié)冰時，細(xì)胞內(nèi)還沒結(jié)冰，細(xì)胞外液電解質(zhì)濃縮，導(dǎo)致滲透壓急劇升高，細(xì)胞內(nèi)水分子滲出細(xì)胞，在細(xì)胞外形成冰晶，有待更多的實(shí)驗(yàn)證明。

日常冷凍切片工作中，染色的質(zhì)控最主要通過細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)染色來了解染液的質(zhì)量，故筆者認(rèn)為新鮮的組織冷凍切片后，切片立即放入AAF液固定30s，隨后取出，常溫晾干后再次放進(jìn)冷凍切片機(jī)機(jī)箱內(nèi)過夜直至第二天上午8點(diǎn)放入全自動染色機(jī)內(nèi)進(jìn)行HE染色，觀察染液的染色力，適用于每天快速冷凍切片工作開展前的全自動染色機(jī)的染色質(zhì)控，可供各病理科參考應(yīng)用。