郝乘儀，于 蕾，楊佳楠

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)

橡子果實(shí)含有豐富的淀粉，可用來(lái)釀酒、制作橡子制品，同時(shí)也可用于畜牧業(yè)的飼料生產(chǎn)，在我國(guó)具有“木糧”“木玉米”的美稱[1]。橡子果實(shí)還含有單寧酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì),其中單寧酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約占果實(shí)的5%～12%[2]。橡子中的單寧酸屬于多酚類(lèi)化合物，具有的抗氧化功能[3]。單寧酸除了抗氧化作用外，還具有抗腫瘤、減肥、抑菌等作用[4]。超聲提取主要是利用了超聲波的“空化效應(yīng)”“機(jī)械效應(yīng)”和“熱效應(yīng)”[5],根據(jù)超聲的特殊物理性質(zhì),利用壓電換能器產(chǎn)生的快速機(jī)械振動(dòng)波來(lái)減少目標(biāo)萃取物與樣品基體之間的作用力,從而達(dá)到固-液萃取分離的目的[6]。中藥中的有效成分在超聲波場(chǎng)作用下不但作為介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)使自身獲得巨大加速度與動(dòng)能,而且利用“空化效應(yīng)”使本身受到劇烈的外力沖擊將成分有效地分離出來(lái)[7]。本研究就對(duì)橡子單寧提取方法以及提取物對(duì)Hep-2(人喉癌上皮細(xì)胞)的作用進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橡子粉(吉林長(zhǎng)白山)，單寧酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

乙腈(色譜級(jí));PBS溶液,1%非必須氨基酸的MEM培養(yǎng)基(北京邁晨科技有限公司),無(wú)支原體胎牛血清(FBS,浙江天杭四季青生物工程有限公司),青霉素和鏈霉素雙抗(北京邁晨科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO,陜西圣瑞醫(yī)藥科技有限公司)。

超聲波清洗器(KQ-300V),離心機(jī)(TG-16WS),循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ型)，LC-20A型島津高效液相色譜儀，DG-3022型酶聯(lián)儀(華東電子管廠)。

1.2 橡子單寧的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定

柱溫30 ℃;色譜柱:Luna C18(250 mm×4.6 mm);固定流動(dòng)相甲醇∶水80∶20。分別稱取1 mg標(biāo)樣和樣品置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶液定容。超聲脫氣,搖勻。待儀器穩(wěn)定后,進(jìn)樣20 μL按樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液的順序進(jìn)樣[8]。

1.3 單寧酸抑制腫瘤實(shí)驗(yàn)

取2～3代Hep-2細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)后經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化[9]。將細(xì)胞懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板(Corning,3599),每孔200 μL約含0.2×104個(gè)細(xì)胞,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h后添加單寧酸溶液。每板設(shè)置溶劑對(duì)照組及8個(gè)含不同濃度的單寧酸培養(yǎng)基(0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、5、20 g/L)。38 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間24 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h各培養(yǎng)孔加入MTT(5 g/L)20 μL。4 h后棄上清液,每孔加入DMSO 100 μL/孔,振蕩10 min后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光值。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件確定

提取溫度在20～40 ℃時(shí)，單寧得率隨著溫度的升高而增大，超過(guò)45 ℃得率下降。溫度控制在25～30 ℃之間過(guò)真空抽濾，濾液再經(jīng)3000 r/min離心10 min，收集上清液并測(cè)定其單寧酸含量，橡子單寧得率最高達(dá)到9.89%,提取率達(dá)到93.67%。分析其原因，可能是由于溫度在一定范圍內(nèi)的升高有助于單寧酸的浸出。由于單寧中含有大量的酚羥基，其熱穩(wěn)定性較差，對(duì)溫度的要求較高，溫度超過(guò)一定范圍時(shí)，單寧酸含量可能會(huì)隨著溫度的升高而發(fā)生變性反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì)。單寧酸也可能由于不穩(wěn)定而發(fā)生其他不可逆的化學(xué)反應(yīng)，從而降低單寧酸的產(chǎn)率。當(dāng)溫度處于65 ℃以上時(shí)，橡子淀粉開(kāi)始發(fā)生糊化反應(yīng)，導(dǎo)致淀粉變性,單寧產(chǎn)率降低，所以提取溫度不宜過(guò)高。

超聲波作用時(shí)間對(duì)提取效果的影響:隨著超聲波作用時(shí)間增長(zhǎng)，單寧溶出率也隨之升高，但是當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)于40 min后，單寧得率開(kāi)始緩慢下降。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)橡子粉中的單寧酸逐漸溶出，使其橡子粉中的單寧酸含量減少。乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，單寧提率最高。

超聲波提取單寧最佳條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、提取次數(shù)3、提取時(shí)間40 min、液固比20∶1(mL/g)。

2.2 單寧酸抑制腫瘤實(shí)驗(yàn)

以最佳提取條件提取單寧酸，對(duì)體外培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞增殖作用在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)的OD值。試驗(yàn)測(cè)得OD值可以直觀地反映出培養(yǎng)基中添加單寧酸對(duì)體外培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞增殖的影響[11]。低濃度的OD值與對(duì)照組相比變化不大,隨著添加濃度的增加OD值降低,高濃度時(shí)OD值減小即單寧酸對(duì)體外培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞的增殖具有抑制作用。低濃度的單寧酸(0.001～0.01 g/L)對(duì)體外培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞的抑制作用不明顯。隨著濃度的增加,單寧酸濃度在0.05～20 g/L時(shí)，24 h體外培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞的抑制率分別大于5.0,且與其他濃度范圍相比差異顯著對(duì)體外培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞的增殖有抑制作用。

2.3 IC50的測(cè)定

IC50為50%抑制濃度，即凋亡細(xì)胞與全部細(xì)胞數(shù)之比等于50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度，可以用來(lái)衡量藥物誘導(dǎo)凋亡的能力。通過(guò)IC50的計(jì)算對(duì)本次MTT實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行挑選，挑選出癌細(xì)胞抑制增殖活性大于50%的濃度，并以濃度、抑制率分別為橫縱坐標(biāo)得出回歸曲線，并計(jì)算出IC50值為9.431 g/L。Hep-2細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間固定為24 h。結(jié)果樣品對(duì)Hep-2的抑制率大于50%,且IC50值小于10 g/L，說(shuō)明單寧酸對(duì)Hep-2細(xì)胞具有顯著的抑制增殖作用。

3 結(jié) 論

橡子是我國(guó)最大野生木本糧食資源，橡子中又含有豐富的單寧酸。單寧酸具有獨(dú)特的化學(xué)特性及特殊的生理和藥理功能,因此在日用化學(xué)工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、皮革行業(yè)及其他方面獲得了極為廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)為橡子的資源開(kāi)發(fā)利用提供參考。