黃文波 馬占忠 范舒舒 徐靜 羅慧旗 劉滿霞 陳玉美

（1.韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，廣東 韶關(guān) 512026；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科、產(chǎn)前診斷中心，廣東 韶關(guān) 512026）

全世界約有15%的夫婦不育，50%與男性因素有關(guān)［1］。Y 染色體無精因子（azoospermia factor，AZF）微缺失是男性不育的重要遺傳因素［2］。本研究采用熒光定量PCR技術(shù)對無精子或嚴(yán)重少精子患者的Y染色體AZF基因的6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)進(jìn)行檢測，從分子水平探討男性不育的病因，為臨床輔助生殖提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年10月在粵北人民醫(yī)院就診的163例無精或嚴(yán)重少精子的患者，年齡24～45歲（平均年齡31.6歲），無精癥或嚴(yán)重少精癥診斷參照 WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。選取50例精液常規(guī)分析正常的健康男性為對照組，兩組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 試劑Y染色體微缺失檢測試劑（PCR熒光探針法）由上海透景生命科技股份有限公司生產(chǎn)，檢測包括AZFa區(qū)的s Y84、s Y86，AZFb區(qū)的s Y127、sY134，AZFc區(qū)的sY254、sY255A以及SRY、ZFX／ZFY位點(diǎn)。核酸提取純化試劑由江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)。儀器：伯樂CFX96熒光定量PCR儀，IMPLEN Nano photometer N50 Touch微量分光光度儀等。

1.2.2 提取DNA，PCR擴(kuò)增采集靜脈血2 ml，EDTA抗凝；取200μl血液樣本，用Blood Gen Mini Kit核酸提取試劑盒提取全血基因組DNA；用微量分光光度儀檢測DNA OD260／OD280，要求在1.8～2.0之間。PCR反應(yīng)體系：A組和B組分別加PCR預(yù)混液22.5μl，樣本DNA模板2.5μl，設(shè)陰性對照和質(zhì)控品。PCR反應(yīng)條件：50℃2 min；95℃5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38 cycles；72 ℃ 5 min；60 ℃ 時(shí)收集 FAM／VIC／ROX／Cy5熒光信號。具體步驟按照試劑盒說明書和相應(yīng)SOP文件操作。

1.2.3 結(jié)果判讀質(zhì)控品結(jié)果為典型的S型擴(kuò)增曲線且Ct＜32，陰性對照4個(gè)通道檢測均無擴(kuò)增曲線。其他樣本位點(diǎn)結(jié)果為典型的S型擴(kuò)增曲線且Ct＜32判為存在，否則判為缺失。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在163例男性不育患者中，共檢出9例Y染色體微缺失，總檢出率為5.52%。包括5例AZFc缺失，檢出率為3.07%；3例為AZFb＋c缺失，檢出率為1.84%；1例為 AZFa＋b＋c缺失，檢出率為0.61%，該患者SRY基因陰性，外周血染色體核型結(jié)果為46，XX，為男性性反轉(zhuǎn)患者。見表1和圖1～4。對照組未檢出Y染色體微缺失。兩組間Y染色體微缺失檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 163例男性不育患者Y染色體AZF微缺失檢測結(jié)果（n＝163）

圖1 健康男性AZF基因PCR擴(kuò)增曲線

圖2 AZFc缺失PCR擴(kuò)增曲線

圖3 AZFb＋c缺失PCR擴(kuò)增曲線

圖4 AZFa＋b＋c缺失且SRY（－）PCR擴(kuò)增曲線

3 討論

Y染色體AZF基因與精子發(fā)生密切相關(guān)，分為AZFa、AZFb、AZFc 3個(gè)區(qū)域，任何一個(gè)區(qū)域微缺失都會(huì)引起無精或少精子癥。AZFa缺失表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征，為絕對的無精子癥，AZFb缺失患者精子生成被阻滯在精母細(xì)胞階段，沒有精子生成，因此，AZFa缺失和AZFb缺失的患者都不能通過單精子胞漿內(nèi)注射，只能選擇供精的方式來生育后代。AZFc缺失是臨床上最常見生精障礙的病因，AZFc缺失患者的臨床表現(xiàn)多樣，有些能生成精子，可以通過輔助生殖技術(shù)生育后代，但是會(huì)將AZFc缺失遺傳給男胎，可通過遺傳咨詢告知風(fēng)險(xiǎn)或者選擇女胚進(jìn)行移植避免遺傳缺陷［4］。

本研究在廣東韶關(guān)地區(qū)163例無精或嚴(yán)重少精子患者中檢出9例Y染色體微缺失，總檢出率為5.52%，AZFc缺失最常見，與國內(nèi)外報(bào)道的AZFc缺失發(fā)生率最高的結(jié)論一致［5，6］。亞洲地區(qū)男性不育患者中AZF微缺失的發(fā)生率在2%～19.4%［7］。廣東省內(nèi)報(bào)道的Y染色體微缺失率由高到低依次是東莞地區(qū)19.2%［8］，深圳地區(qū)10%～14.29%［9，10］，廣州地區(qū)5.3%～10.9%［11，12］，惠州地區(qū)9.02%［13］，潮州地區(qū)7.14%［14］，佛山地區(qū)6.6%［15］。各文獻(xiàn)報(bào)道的檢出率差異較大，與所選的研究對象和采用檢測方法和位點(diǎn)不盡相同有關(guān)，也可能存在種族和地域的差異。

目前，Y染色體微缺失可采用熒光定量PCR法、PCR瓊脂糖凝膠電泳法、毛細(xì)管電泳法、基因芯片法和熒光原位雜交法等，本文所用的熒光定量PCR法自動(dòng)化程度高，操作簡便，不需要電泳等繁瑣的步驟，是一種簡便高效的檢測方法。但有文獻(xiàn)報(bào)道基因多態(tài)性可能會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增失敗引起假陽性的風(fēng)險(xiǎn)需引起重視［16，17］，必要時(shí)采用 PCR 毛細(xì)管電泳測序確認(rèn)。

歐洲男科協(xié)會(huì)和分子遺傳質(zhì)量協(xié)作網(wǎng)EAA／EMQN出版的指南［18］，首次提出了AZF篩查的規(guī)范化流程、遺傳咨詢和輔助生殖等相關(guān)內(nèi)容。Y染色體微缺失分析已經(jīng)成為一項(xiàng)常規(guī)的檢查項(xiàng)目，可明確無精子癥或少精子癥患者的病因、指導(dǎo)選擇輔助生殖方式，對實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。