天麻鉤藤飲對帕金森病模型大鼠行為學(xué)及紋狀體內(nèi)多巴胺含量的影響

張立娟 張 倩 王康鋒 李思毅 楊 潔 王慶慶 彭 偉

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南250014； 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，陜西西安710000）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD），又稱震顫麻痹，是一種嚴(yán)重危害老年人健康的神經(jīng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)有靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩及自主神經(jīng)癥狀等。該病多見于中老年人，在年齡大于65歲的人群中發(fā)病率大約為1%～3%，僅次于阿爾茨海默病[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國目前PD患者已經(jīng)超過百萬，預(yù)計到2030年我國PD患者人數(shù)將達(dá)到500萬[2]，這必然給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。遺憾的是，PD的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，目前依然沒有有效根治方法，現(xiàn)有的臨床治療方法只能緩解癥狀，卻不能阻止或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程。近年來我們在臨床上應(yīng)用天麻鉤藤飲治療PD取得滿意療效，但其取效機(jī)制仍不明確。本研究以6-羥基多巴胺（6-OHDA）致PD模型大鼠為研究對象，從行為學(xué)和神經(jīng)遞質(zhì)角度探討天麻鉤藤飲對PD的治療作用及其機(jī)理，以期為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物 SD大鼠65只，雄性，SPF級，200～220g，由山東省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：CSXK（魯）20140007。

1.2 儀器 多功能腦立體定位儀：Stoelting，美國；低溫離心機(jī)：型號為MICROMAX RF，Thermo IEC（美國）；高速離心機(jī)：型號為1-13，SIGMA（德國）；5μL微量進(jìn)樣器，產(chǎn)自上海安亭微量進(jìn)樣器廠。

1.3 藥物 美多芭（多巴絲肼片）：上海羅氏制藥有限公司，生產(chǎn)批號H10930198；天麻鉤藤飲：天麻9g，鉤藤12g，石決明18g，梔子9g，黃芩9g，川牛膝12g，杜仲9g，桑寄生9g，夜交藤9g，茯神9g，益母草9g，藥材煎煮2次合并濾液并濃縮。

1.4 試劑 6-羥基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）、阿撲嗎啡（APO），均為Sigma公司產(chǎn)品；ELISA試劑盒：大鼠多巴胺（Dopamine，DA），批號201611，聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模 術(shù)前按常規(guī)對大鼠進(jìn)行行為學(xué)測試，確認(rèn)無異常旋轉(zhuǎn)行為后，3%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉。參照文獻(xiàn)方法，將大鼠固定在腦立體定位儀上，剪去顱頂?shù)氖竺玫夥Ｒ?guī)消毒，沿正中線切開大鼠顱頂皮膚，剝離骨膜，暴露前后囟[3]。純雙氧水擦拭顱骨表面，以前囟為準(zhǔn)，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》[4]，確定右側(cè)黑質(zhì)二坐標(biāo)：（1）前囟后5.2mm，正中線右側(cè)1.0mm，硬膜下9.0mm；（2）前囟后5.2mm，正中線右側(cè)2.5mm，硬膜下8.5mm。用牙科鉆于手術(shù)部位小心鉆開顱骨，用5μL微量進(jìn)樣器將6-OHDA（溶于含0.02%抗壞血酸的生理鹽水中，濃度為2μg/μL）溶液注入右側(cè)黑質(zhì)部（以1.0mm/min速度緩慢進(jìn)針），每孔3μL，注射速度為1μL/min，注射完畢后留針5min，然后以1.0mm/min速度緩慢退針。手術(shù)完成后，用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔，縫合皮膚切口，肌肉注射慶大霉素（20萬單位/只，共7d），待動物清醒后放回籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組只注射含0.02%抗壞血酸的等量生理鹽水，其余處理同造模組。造模手術(shù)10d以后，腹腔注射阿撲嗎啡（APO）0.5mg/kg誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄開始旋轉(zhuǎn)至30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，以旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均每分鐘超過7次者為合格的PD模型[5]。

2.2 分組與給藥 造模成功后，通過隨機(jī)數(shù)字表法將PD模型大鼠隨機(jī)分為模型組、天麻鉤藤飲高劑量組、天麻鉤藤飲低劑量組和西藥組，另設(shè)假手術(shù)組，共5組。天麻鉤藤飲低、高劑量組分別予天麻鉤藤飲11.88g/（kg·d）、47.52g/（kg·d）灌胃，分別相當(dāng)于臨床人日用量的6.25、25倍量；西藥組予美多芭75g/（kg·d）灌胃；模型組、假手術(shù)組予等量生理鹽水灌胃。共干預(yù)8周。

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 行為學(xué)測試 行為學(xué)測試包括懸掛試驗(yàn)和震顫麻痹評分。于治療前后分別進(jìn)行。

懸掛試驗(yàn)（參照Kuribara法改良）[6]：該試驗(yàn)?zāi)康氖菣z測大鼠肢體運(yùn)動的協(xié)調(diào)情況。將大鼠兩前爪懸掛于水平固定的金屬桿上，金屬桿直徑1.5mm，距離地面70cm，記錄大鼠懸掛時間，僅一爪抓住繩子屬失敗。根據(jù)懸掛實(shí)際進(jìn)行評分：0～4s評0分；5～9s評1分；10～14s評2分；15～19s評3分；20～24s評4分；25～29s評5分；超過30s評6分。每隔5min測1次，共測3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)[7]：大鼠腹腔內(nèi)注射APO（0.5mg/kg），10min后觀察并記錄大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，表現(xiàn)為以對側(cè)的前肢或后肢為支撐點(diǎn)，頭尾相接，身體彎曲成環(huán)狀向損傷對側(cè)旋轉(zhuǎn)，共記錄30min。

2.3.2 紋狀體內(nèi)DA含量檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，取腦，剝離紋狀體，存放于-80℃冰箱。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA法）測定紋狀體中DA含量，具體方法參考試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量分析 假手術(shù)組大鼠均全部存活。其余55只大鼠在6-OHDA注射過程中死亡5只，術(shù)后10d存活48只。腹腔注射阿撲嗎啡誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，從開始旋轉(zhuǎn)至30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均每分鐘超過7次者共42只，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取40只成功模型，分為模型組、天麻鉤藤飲高劑量組、天麻鉤藤飲低劑量組和西藥組，最終納入結(jié)果分析的大鼠50只，每組10只。

3.2 行為學(xué)測試結(jié)果

3.2.1 懸掛試驗(yàn)結(jié)果 見表1。治療前模型組、天麻鉤藤飲高劑量組、天麻鉤藤飲低劑量組和西藥組得分均明顯低于假手術(shù)組（P＜0.01），模型組、天麻鉤藤飲高劑量組、天麻鉤藤飲低劑量組和西藥組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后天麻鉤藤飲高、低劑量組和西藥組得分均顯著高于模型組（P＜0.01），其中天麻鉤藤飲高劑量組得分最高，與低劑量組、西藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低劑量組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠懸掛試驗(yàn)得分情況比較（±s） 分

表1 各組大鼠懸掛試驗(yàn)得分情況比較（±s） 分

注：**與同時期假手術(shù)組比較，P＜0.01；##與同時期模型組比較，P＜0.01；▲與同時期天麻鉤藤飲低劑量組、西藥組比較，P＜0.05。

假手術(shù)組 10 5.50±0.77 5.90±0.32模型組 10 1.30±1.06** 1.00±0.94天麻鉤藤飲高劑量組 10 1.40±1.17** 4.50±1.08##▲天麻鉤藤飲低劑量組 10 1.60±1.27** 3.30±1.34##西藥組 10 1.5±1.27** 3.30±1.89##

3.2.2 旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果 見表2。治療前模型組、天麻鉤藤飲高劑量組、天麻鉤藤飲低劑量組和西藥組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），治療后天麻鉤藤飲高、低劑量組和西藥組旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均明顯低于模型組（P＜0.01），其中天麻鉤藤飲高劑量組旋轉(zhuǎn)圈數(shù)最少，與低劑量組、西藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），低劑量組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠30min旋轉(zhuǎn)圈數(shù)比較（±s） 圈

表2 各組大鼠30min旋轉(zhuǎn)圈數(shù)比較（±s） 圈

注：**與同時期假手術(shù)組比較，P＜0.01；##與同時期模型組比較，P＜0.01；▲▲與同時期天麻鉤藤飲低劑量組、西藥組比較，P＜0.01。

組別 動物數(shù)（只） 治療前 治療后假手術(shù)組 10 0 0模型組 10 253.18±18.09 256.40±13.43**天麻鉤藤飲高劑量組 10 257.20±18.47 148.10±15.15**##▲▲天麻鉤藤飲低劑量組 10 246.60±12.92 186.20±12.94**##西藥組 10 249.10±18.29 175.90±14.72**##

3.3 各組大鼠治療后紋狀體內(nèi)DA含量比較 見表3。模型組、天麻鉤藤飲高劑量組、天麻鉤藤飲低劑量組和西藥組大鼠DA含量均明顯低于假手術(shù)組（P＜0.01），治療后天麻鉤藤飲高、低劑量組和西藥組DA含量較模型組顯著升高（P＜0.01），其中天麻鉤藤飲高劑量組DA含量升高最明顯，與低劑量組、西藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低劑量組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠治療后紋狀體內(nèi)DA含量比較（±s）

表3 各組大鼠治療后紋狀體內(nèi)DA含量比較（±s）

注：**與同時期假手術(shù)組比較，P＜0.01；##與同時期模型組比較，P＜0.01；▲與同時期天麻鉤藤飲低劑量組、西藥組比較，P＜0.05。

組別 動物數(shù)（只） DA含量（pg/mL）假手術(shù)組 10 56.50±9.35模型組 10 33.45±5.77**天麻鉤藤飲高劑量組 10 49.27±6.87**##▲天麻鉤藤飲低劑量組 10 41.34±5.55**##西藥組 10 42.75±5.21**##

4 討論

帕金森病是一種臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，受損部位位于黑質(zhì)紋狀體，該病主要病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞漸進(jìn)性減少和神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)路易小體（LB）[8]。目前，國際神經(jīng)科學(xué)界一致認(rèn)為PD治療的理想目標(biāo)是控制癥狀，提高患者生存質(zhì)量，延緩病程進(jìn)展，延長控制癥狀藥物使用的年限，以及減少藥物的不良反應(yīng)和并發(fā)癥[9]。近年來中醫(yī)藥療法治療PD在臨床上取得了滿意療效，越來越受到臨床醫(yī)生的重視，具有重要的研究意義。

帕金森病屬于中醫(yī)“顫證”范疇，病因多為年老體虛，肝腎虧損，肝風(fēng)內(nèi)動，氣血陰陽虧虛，筋脈失養(yǎng)，治療當(dāng)以補(bǔ)腎平肝息風(fēng)為法。而天麻鉤藤飲具有平肝息風(fēng)、補(bǔ)益肝腎之效，切中病機(jī)，為臨床治療PD的常用方劑?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，天麻的有效成分主要是天麻素和天麻苷元，有臨床研究證實(shí)天麻素能夠使PD合并輕度認(rèn)知功能損害患者的認(rèn)知功能明顯改善，尤其在視空間與執(zhí)行、語言流暢及延遲記憶等方面改善明顯[10]。動物實(shí)驗(yàn)表明，天麻素可以抑制多巴胺代謝率，使多巴胺含量升高，并對多巴胺能神經(jīng)元的形態(tài)及功能有保護(hù)作用，減慢多巴胺神經(jīng)元的代謝速度進(jìn)而減少多巴胺的自身氧化，提高多巴胺神經(jīng)元攝取中的酪氨酸和胞質(zhì)內(nèi)酪氨酸羥化酶（TH）、多巴胺脫氫酶（DDC）的活性，促進(jìn)多巴胺生成，以對抗多巴胺神經(jīng)元死亡造成的多巴胺含量下降[11-12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：天麻鉤藤飲可以改善PD大鼠行為學(xué)癥狀，延長PD大鼠懸掛時間，減少阿撲嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，其中高劑量組療效最明顯，低劑量組與西藥組療效相當(dāng)；干預(yù)8周后，天麻鉤藤飲高劑量組大鼠紋狀體DA含量明顯升高，與低劑量組、西藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低劑量組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。由此我們推測，天麻鉤藤飲治療帕金森病的取效機(jī)制可能與促進(jìn)PD大鼠內(nèi)源性多巴胺分泌，有效改善PD大鼠腦內(nèi)微環(huán)境和神經(jīng)元代謝有關(guān)。

綜上所述，天麻鉤藤飲可以明顯改善PD大鼠行為學(xué)癥狀，提高黑質(zhì)紋狀體內(nèi)多巴胺含量，如果將其用于輕度或早期帕金森患者，可推遲臨床使用西藥，減少西藥用量或縮短療程，從而減少西藥治療的不良反應(yīng)，值得進(jìn)一步推廣。本次實(shí)驗(yàn)還未涉及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)代謝指標(biāo)的具體起效時間、起效通路以及相關(guān)蛋白、基因等指標(biāo)，還有很多內(nèi)容需要探索及深入研究，以期為臨床應(yīng)用天麻鉤藤飲治療PD提供更加明確的科學(xué)依據(jù)。

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