許文芳，費迎明，周建康，陳將南，周亞娣，呂秋瓊

1.紹興市立醫(yī)院檢驗科，浙江 紹興 312000；

2.紹興市立醫(yī)院消化內科，浙江 紹興 312000

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在全世界腫瘤發(fā)病率中居第6位，腫瘤相關死亡中居第2位［1］，特別是在中國及東南亞地區(qū)，HCC的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，形勢非常嚴峻。HCC細胞具有很強的增殖能力，HCC進展快速、預后較差，抑制HCC細胞增殖能夠有效提高HCC的綜合治療效果。然而，HCC細胞的增殖是一個多基因參與、多信號分子及通路共同調節(jié)的復雜過程，其確切機制尚未完全闡明。XB130蛋白是肌動蛋白絲相關蛋白1(actin filament associated protein 1，AFAP1)家族的新成員，又被稱為肌動蛋白絲相關蛋白1L2(AFAP1L2)［2］。作為一種銜接蛋白，被酪氨酸磷酸化的XB130可活化調控磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylin-ositol 3-kinase，PIK3)/絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase，AKT)通路、Rac依賴性通路等重要信號通路，參與調節(jié)細胞生存、增殖、轉移和侵襲等多種重要細胞過程［3-4］。相關研究顯示，抑制XB130蛋白的表達，在胃癌、食管癌及前列腺癌等多種腫瘤中，均有抑制腫瘤細胞增殖的效果［5-7］。因此，本研究通過RNA干擾技術抑制HCC細胞中XB130蛋白的表達，評估XB130蛋白缺失對HCC細胞增殖能力和細胞周期的影響，并對其下游相關的蛋白及mRNA進行檢測。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和細胞株

胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基及DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；各培養(yǎng)基加入10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素后使用。XB130、p-AKT、p-糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK)3β、cyclin D1及p-Rb一抗均購自美國Cell Signal公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗購自上海康成生物工程有限公司，HRP結合的山羊抗小鼠二抗和HRP結合的山羊抗兔二抗均購自中山生物工程有限公司，組織細胞裂解液購自美國Cell Signal公司，上樣緩沖液購自美國Invitrogen公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific Inc公司，蛋白預染Marker(protein marker 0671)購自美國Fermentas公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，化學發(fā)光試劑盒購自美國GE Healthcare公司，ECL發(fā)光增強劑購自美國Pierce公司，膠片和顯影定影液購自美國Kodak公司，Negative Control siRNA(NC-siRNA)和XB130-siRNA均購自美國Santa Cruz公司，LipofectamineTM2000和RNA抽提液TRIzol Reagent均購自美國Invitrogen公司，無血清培養(yǎng)基Opti-MEM transfection medium購自美國Gibco公司。用于反轉錄的Prime Script Reagent RT Kit購自寶生物工程(大連)有限公司，XB130、cyclin E1、c-Myc、PCNA及β-actin的引物設計也由寶生物工程(大連)有限公司完成。細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購自日本同仁化學研究所，人肝癌細胞系(Huh7、HepG2和SNU-449)和正常肝臟細胞系(HL7702)均購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。

1.2 細胞培養(yǎng)

Huh7和HepG2細胞置于DMEM培養(yǎng)基中，SNU-449和HL7702細胞置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 XB130-siRNA轉染沉默XB130表達

6孔培養(yǎng)板中每孔加入2×105個Huh7細胞，培養(yǎng)至40%～60%融合。于聚苯乙稀管中制備以下轉染液：用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋100 pmol XB130-siRNA或NC-siRNA至250 μL/孔，于37 ℃溫箱中溫育5 min；用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋5 μL LipofectamineTM2000至250 μL/孔，于37 ℃溫箱中溫育5 min；輕輕混合上述兩種液體，于37 ℃溫箱中溫育包埋15 min。將6孔板中的無血清培養(yǎng)基吸除，把轉染液緩緩加入培養(yǎng)板中，并用Opti-MEM培養(yǎng)基補足轉染體系至2 mL/孔，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，吸除轉染體系，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后檢測XB130 mRNA表達水平，48 h后檢測XB130蛋白表達水平，并于72 h內完成后續(xù)實驗。

1.4 CCK-8檢測細胞活力

96孔培養(yǎng)板中每孔加入5×103個Huh7細胞(XB130-siRNA轉染、NC-siRNA轉染和對照)，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)特定的時間(24、48或72 h)。向每孔加入10 μL CCK-8溶液(稀釋入DMEM培養(yǎng)基中為10%工作液)，注意不要生成氣泡，氣泡會折光影響吸光度(D)值；然后置96孔板于37 ℃溫箱中溫育0.5～4.0 h，用酶標儀測定450 nm處的D值。根據(jù)D值計算相對細胞活性，V%=(處理組D值/對照組D值)×100%。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期

6孔培養(yǎng)板中每孔加入2×105個Huh7細胞，血清饑餓同步化24 h，然后分別用XB130-siRNA或NC-siRNA轉染，48 h后用胰酶消化，離心收集細胞，PBS洗兩遍，棄上清液，加入70%預冷乙醇中，吹打均勻，4 ℃固定12 h以上。然后用PBS洗滌去乙醇，洗2遍。并用含50 μg/mL溴化乙啶和0.2%Triton X-100的PBS 0.5 mL重懸細胞，加入100 μg/mL RNase A，4 ℃避光溫育30 min。用流式細胞儀測定細胞周期，一般計數(shù)20 000～30 000個細胞(不少于10 000)，結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析，計算G0/G1、S及G2/M期細胞比例。

1.6 蛋白［質］印跡法(Western blot)檢測蛋白表達

收集細胞，加入6倍體積的細胞裂解液，冰上裂解1 h；4 ℃下，裂解混合液于12 000×g條件下離心15 min，取其上清液用蛋白質定量試劑盒BCA法定量，將蛋白樣品調至等濃度，混合上樣緩沖液后100 ℃蛋白變性5 min。制備10%的SD-PAGE膠，室溫垂直靜置30 min。安裝電泳裝置，上下槽中注入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，泳道中加5 μL的蛋白標志物或10 μL(60 μg)的實驗組蛋白后電泳。安裝電轉膜裝置，注入轉膜液，將蛋白電轉膜至PVDF膜。將膜取出、TBS-T液稍漂洗，然后浸沒于封閉液(5%脫脂奶粉的TBS液)，室溫封閉2 h。TBS-T液洗膜3次，每次5 min。將其浸沒于p-AKT、p-GSK3β、cyclin D1、p-Rb和GAPDH的一抗液(1∶1 000稀釋)中，4 ℃溫育6 h。TBS-T液洗膜3次，每次5 m i n。再將其浸沒于H R P標記的二抗液(1∶5 000稀釋)中，室溫溫育2 h。TBS-T液洗膜3次，每次5 min。滴加HRP-ECL發(fā)光液發(fā)光，暗室曝光，顯影定影并掃描分析。

1.7 反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)檢測mRNA表達

用T R Izol R NA試劑盒提取Huh7細胞(XB130-siRNA轉染、NC-siRNA轉染和對照的總RNA)，取2 μg RNA，按照廠商說明用Prime Script Reagent RT Kit試劑盒進行反轉錄。XB130上游引物為5’-AGCACAGC ACTGGTGAAGAA-3’，下游引物為5’-GTTG CTTGTTGATGGTCACT-3’；Cyclin E1上游引物為5’-CTGGATGTTGACTGCCTTGA-3’，下游引物為5’-TCTTTGGTGGAGAAGGATGGGGTGG-3’；c-Myc上游引物為5’-GCAGCTGCTTAGACGCTGGA-3’，下游引物為5’-CGCAGTAGAAATACGGCTGCAC-3’；PCNA上游引物為5’-GTGAATTTGCACGTATATGCCG-3’，下游引物為5’-GCAATTTTATACTCTACAACAAGG GG-3’。PCR反應儀采用上海Applied Biosystems Inc公司的ABI 7900 Prism HT，數(shù)據(jù)處理采用melting curve分析，XB130、cyclin E1、c-Myc和PCNA的mRNA表達量均標準化到β-actin(上游引物為5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物為5’-CTA AGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’)。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 XB130蛋白在Huh7、HepG2、SNU449和HL7702細胞中的表達差異

Western blot檢測結果顯示，XB130蛋白在Huh7、HepG2、SNU449和HL7702細胞中的相對表達量分別為0.66±0.10、0.78±0.11、0.83±0.08和0.32±0.06；與HL7702細胞比較，各HCC細胞中XB130的表達明顯升高(P＜0.01)，而3種人肝癌細胞系之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖1)。

圖 1 Western blot檢測Huh7、HepG2、SNU449和HL7702細胞中XB130蛋白的表達情況Fig. 1 The protein expressions of XB130 in Huh7, HepG2,SNU449 and HL7702 cells detected by Western blot

2.2 XB130-siRNA轉染對Huh7細胞中XB130蛋白和mRNA表達的影響

Western blot檢測結果顯示，在空白對照組、NC-siRNA轉染組和XB130-siRNA轉染組Huh7細胞中，XB130蛋白的相對表達量分別為0.67±0.14、0.62±0.11和0.12±0.07；與空白對照組比較，NC-siRNA轉染組細胞中XB130蛋白的相對表達量無明顯變化，與NC-siRNA轉染組比較，XB130-siRNA轉染組細胞中XB130蛋白的相對表達量明顯降低(P＜0.01，圖2)。

圖 2 各組Huh7細胞中XB130蛋白的表達Fig. 2 The protein expressions of XB130 in the difference groups of Huh7 cells

RT-PCR檢測結果顯示，XB130 mRNA表達水平上的改變和Western blot的結果一致，抑制率達(77.92±4.64)%，抑制效果顯著(P＜0.001，圖3)。

圖 3 各組Huh7細胞中XB130 mRNA的表達Fig. 3 The expressions of XB130 mRNA in the difference groups of Huh7 cells

2.3 沉默XB130基因對Huh7細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗檢測結果顯示，XB130-siRNA轉染后24、48 h，空白對照組、NC-siRNA轉染組和XB130-siRNA轉染組中Huh7細胞活力差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖4)；而轉染后72 h，與空白對照組比較，NC-siRNA轉染組Huh7細胞活力無明顯差異，而與NC-siRNA轉染組比較，XB130-siRNA轉染組Huh7細胞活力明顯降低，為空白對照組細胞活力的(69.19±2.11)%(P＜0.001，圖4)。

圖 4 24、48和72 h時各組Huh7細胞活力Fig. 4 The viability of Huh7 cells after 24, 48 and 72 h

通過細胞計數(shù)法繪制細胞生長曲線，結果顯示，空白對照組和NC-siRNA轉染組168 h生長曲線差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖5)；XB130-siRNA轉染組與NC-siRNA轉染組比較，生長曲線于72 h開始顯著降低(P＜0.001，圖5)。

2.4 沉默XB130對Huh7細胞周期的影響

流式細胞術檢測結果顯示，轉染XB130-siRNA后48 h，與空白對照組比較，NC-siRNA轉染組Huh7細胞不同時期細胞的比例無明顯改變(P＞0.05，圖6)；而與NC-siRNA轉染組比較，XB130-siRNA轉染組Huh7細胞中，G0/ G1期細胞比例明顯升高(P＜0.001，圖6)，達到(68.20±1.51)%，S和G2/M期細胞比例則降低(P＜0.01，圖6)，分別降至(20.30±0.79)%和(11.50±0.74)%。

圖 5 各組Huh7細胞生長曲線Fig. 5 The growth curves of Huh7 cells

圖 6 各組Huh7細胞中不同細胞周期的比例Fig. 6 The ratio of Huh7 cells in the different cell cycle phases

2.5 沉默XB130對Huh7細胞周期相關蛋白的影響

Western blot檢測結果顯示，在空白對照組、NC-siRNA轉染組和XB130-siRNA轉染組Huh7細胞中，p-AKT蛋白的相對表達量分別為0.87±0.17、0.93±0.22和0.34±0.14，p-GSK3β蛋白的相對表達量分別為0.90±0.24、0.92±0.19和0.53±0.11，cyclin D1蛋白的相對表達量分別為0.93±0.26、0.89±0.29和0.47±0.16，p-Rb蛋白的相對表達量分別為0.90±0.23、0.92±0.28和0.58±0.17；與空白對照組比較，NC-siRNA轉染組細胞中p-AKT、p-GSK3β、cyclin D1及p-Rb蛋白的相對表達量無明顯變化，與NC-siRNA轉染組比較，XB130-siRNA轉染組細胞中p-AKT、p-GSK3β、cyclin D1及p-Rb蛋白的相對表達量明顯降低(P＜0.01，圖7)。

圖 7 各組Huh7細胞中周期相關蛋白的表達Fig. 7 The expressions of cell cycle related proteins in different Huh7 cells

2.6 沉默XB130對Huh7細胞周期相關轉錄因子的影響

RT-PCR檢測結果顯示，轉染XB130-siRNA后的Huh7細胞，其E2F/DP-1的靶基因cyclin E1、c-Myc和PCNA的mRNA表達，較NC-siRNA轉染組均明顯下降(P均＜0.001，圖8)，分別降至(57.44±3.61)%、(42.05±8.83)%和(48.72±3.82)%。

圖 8 各組Huh7細胞中E2F/DP-1靶基因的表達Fig. 8 The expressions of E2F/DP-1 target genes in different Huh7 cells

3 討 論

本研究以XB130為切入點，以HCC細胞增殖為研究對象，應用siRNA干擾技術，證實了XB130在細胞增殖中的重要作用，探索了XB130調控HCC細胞周期的可能機制。

本研究結果顯示，XB130蛋白在HCC細胞系中的表達較正常肝細胞明顯升高，提示XB130可能和HCC發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關性。XB130蛋白可以調節(jié)腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲等生物學過程，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。我們通過沉默HCC細胞的XB130基因后，發(fā)現(xiàn)細胞增殖能力會受到明顯抑制。這些結果表明，XB130可能與細胞惡性病變有關，作為一種原癌基因在HCC細胞中高表達，并對其細胞增殖發(fā)揮重要作用。

有研究報道，抑制胃癌、食管癌和前列腺癌中的XB130可引起細胞周期的G0/G1期阻滯［5-7］。為了進一步了解XB130基因調控HCC細胞增殖的機制，我們檢測了沉默XB130基因后Huh7細胞周期的改變。結果發(fā)現(xiàn)，沉默XB130基因48 h后，G0/G1期Huh7細胞比例明顯升高，說明XB130蛋白在HCC中能夠促進細胞從G0期進入G1期，從而促進細胞的增殖。

XB130蛋白包含有數(shù)個酪氨酸磷酸化位點、1個Src同源結構域2(SH2)和3個SH3，故其可被酪氨酸磷酸化，進而與PI3K的亞單位p85α結合并激活下游的AKT，調控細胞周期、細胞凋亡等過程［3-4］。為了探索XB130在HCC中調控細胞增殖和細胞周期的可能機制，本研究測定了細胞中p-AKT、p-GSK3β、cyclin D1及p-Rb的蛋白表達和E2F/DP-1的靶基因mRNA表達。結果發(fā)現(xiàn)，p-AKT、p-GSK3β表達下降，提示在HCC中XB130基因受抑制也可以導致AKT磷酸化水平下調，并進而影響GSK3β的磷酸化水平。AKT的失活伴隨GSK3β的活化，會使cyclin D1表達下降，抑制周期蛋白依賴性激酶CDK4/6的活性，導致其下游的Rb蛋白磷酸化受限，E2F/DP-1轉錄因子復合物難以發(fā)揮轉錄激活細胞周期的功能［8］；而本實驗結果也顯示，cyclin D1和p-Rb表達下調，以及E2F/DP-1靶基因cyclin E1、c-Myc和PCNA表達下調。上述結果提示，XB130蛋白可能是通過活化PI3K/AKT通路，調控細胞周期蛋白及下游轉錄因子，從而影響Huh7細胞的增殖能力。

XB130在HCC細胞增殖中發(fā)揮重要作用，可以成為HCC治療的一個新靶點。

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