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      基于生存分析的三疣梭子蟹無水?;罴夹g(shù)研究

      2018-03-10 02:49:17尚海濤俞靜芬林旭東凌建剛
      水產(chǎn)科學(xué) 2018年1期
      關(guān)鍵詞:保活梭子蟹溶解氧

      尚海濤,俞靜芬,朱 麟,崔 燕,林旭東,凌建剛

      ( 1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,浙江 寧波 315040;2.寧波市農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程重點實驗室,浙江 寧波 315040 )

      梭子蟹(Portunus)(俗稱白蟹、槍蟹、飛蟹)是我國大型海洋經(jīng)濟(jì)蟹類,是沿海重要的漁業(yè)資源[1]。三疣梭子蟹(P.trituberculatus)肉質(zhì)細(xì)嫩、脂膏肥滿、味道鮮美、營養(yǎng)豐富,是海中珍品,可蒸、煎、炒,亦可蔥油、湯類,還可鮮食、腌食等。傳統(tǒng)的梭子蟹運輸方法有有水保活法(活水運輸)、冰鮮法(加冰運輸)、冷凍法等。無水保活,又稱離水?;睿蚍Q干法運輸,是對傳統(tǒng)運輸方法的一次革新,具有低成本、低污染、方便實用等優(yōu)點。研究較多的有鯽魚(Carassiusauratus)[2]、羅非魚(Oreochromissp.)[3]、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[4]等魚類,還有日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)[5]、日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)[6]等蝦類,及海灣扇貝(Argopectenirradians)[7]、厚殼貽貝(Mytiluscrassitesta)[8]等貝類?;罘椒ā?/p>

      生存分析是將事件的結(jié)果(終點事件)和出現(xiàn)這一結(jié)果所經(jīng)歷的時間結(jié)合起來分析的一種統(tǒng)計分析方法。由于它考慮了每個觀測出現(xiàn)某一結(jié)局的時間長短,可以更好地描述終點事件發(fā)生規(guī)律。在醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中具有廣泛而重要的應(yīng)用價值。近年來許多研究者更是將其應(yīng)用到生態(tài)學(xué)[9]、工程學(xué)[10]、社會學(xué)[11]、經(jīng)濟(jì)學(xué)[12]、計算機(jī)科學(xué)[13]等領(lǐng)域。

      筆者將梭子蟹死亡作為終點事件,研究有水充氣、有水未充氣、高氧、高氧低二氧化碳等處理對三疣梭子蟹生存狀況的影響,應(yīng)用生存分析揭示三疣梭子蟹死亡規(guī)律,探析致死原因,以期為三疣梭子蟹的無水保活技術(shù)的應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)參考。

      1 材料與方法

      1.1 材料與設(shè)備

      試驗用三疣梭子蟹購于寧波象山中國水產(chǎn)城。海水晶(上海保嘉工貿(mào)有限公司);鈉石灰(上海納輝干燥試劑廠);高純氧氣、氮氣、二氧化碳(寧波市方辛氣體公司)。

      S-80B型增氧機(jī)(寧波橫溪賽爾電器廠);LQP-B-4制冰機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);CheckPoint型O2/CO2氣體分析儀(丹麥PBI Dansensor公司);FG4型便攜式溶解氧測定儀[梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司];MAP-H360型盒式包裝機(jī)(蘇州森瑞保鮮設(shè)備有限公司)。

      1.2 方法

      1.2.1 原料預(yù)處理

      試驗蟹為海捕野生三疣梭子蟹雄蟹,捆綁螯足,規(guī)格一致(150~200 g),活潑健康。采用有水充氣的方法5 h內(nèi)運回寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所實驗室,再次挑選出活力強(qiáng)的蟹用于試驗。

      1.2.2 離水干露試驗

      將50只梭子蟹,隨機(jī)分成5組,每組10只,無水干露于塑料箱中,置于8~10 ℃冷庫中,每2 h觀察一次,評價梭子蟹活力,記錄死亡蟹個數(shù)和死亡時間。

      1.2.3 有水充氣試驗

      將50只梭子蟹,隨機(jī)分成5組,每組10只,放置在8~10 ℃冷庫中的有水塑料箱中(按海水晶使用方法配制),充氣增氧。每12 h觀察一次,評價梭子蟹活力,并記錄死亡蟹個數(shù)和死亡時間。同時,測定水體溶解氧含量,并更換水體一次。

      1.2.4 有水未充氣試驗

      處理同1.2.3,但未充氣,放置在8~10 ℃冷庫中,每2 h觀察一次,評價梭子蟹活力,并記錄死亡蟹個數(shù)和死亡時間。同時測定水體溶解氧含量。

      1.2.5 加冰試驗

      將50只梭子蟹,隨機(jī)分成5組,每組10只,無水狀態(tài)下置于塑料箱中,加入碎冰(蟹冰量約為1∶1.5),放置在8~10 ℃冷庫中,每1 h觀察一次,評價梭子蟹活力,記錄死亡蟹個數(shù)和死亡時間。

      1.2.6 高氧試驗

      將50只梭子蟹,以1層濕毛巾、2只蟹的方式置于包裝盒內(nèi),采用盒式包裝機(jī)充入80%氧氣,自動熱壓封口。然后放置在8~10 ℃冷庫中,每8 h測定包裝盒內(nèi)氧氣和二氧化碳含量,拆封觀察一次,評價梭子蟹活力,并記錄死亡蟹個數(shù)和死亡時間,觀察后活蟹按拆口前測定的氧氣和二氧化碳含量再次充氣繼續(xù)試驗。

      1.2.7 高氧低二氧化碳試驗

      處理同1.2.6,只是預(yù)先在每個包裝盒內(nèi)放入20 g鈉石灰。

      1.3 測試項目與方法

      1.3.1 活力評價與死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)

      5人評分小組按表1對梭子蟹活力進(jìn)行評價,并以0級活力作為蟹死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)。

      1.3.2 溶解氧含量與氧氣/二氧化碳含量測定

      采用溶解氧測定儀測定水體中溶解氧含量。采用氣體分析儀測定包裝盒內(nèi)的氧氣/二氧化碳含量。

      1.4 統(tǒng)計方法

      試驗結(jié)果采用SPSS 18.0軟件,進(jìn)行乘積極限法生存分析和Log-Rank檢驗,差異顯著性水平為0.05。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 三疣梭子蟹的生存曲線

      捕撈后生存環(huán)境的變化使梭子蟹陸續(xù)死亡,其生存曲線見圖1。生存分析結(jié)果表明,不同?;钐幚黹g平均生存時間存著顯著性差異(P<0.05)(表2)。各處理下梭子蟹平均生存時間由長到短依次為有水充氣?;?68.4 h)>高氧低二氧化碳?;?53.1 h)>高氧?;?38.4 h)>離水干露(7.6 h)>有水未充氣?;?2.6 h)>加冰保活(1.8 h)。

      圖1 不同處理下三疣梭子蟹的生存曲線

      活力值操作方法表現(xiàn)死亡與否4~53~42~32~31~20~10抓起梭子蟹如抓起梭子蟹未見蟹足明顯伸縮輕掀蟹臍蟹足伸縮有力,頻率高蟹足伸縮有力,頻率中蟹足伸縮無力,頻率低蟹足伸縮有力,頻率高蟹足伸縮有力,頻率中蟹足伸縮無力,頻率低仍未見蟹足明顯伸縮活蟹死蟹

      表2 不同處理下三疣梭子蟹生存表的平均生存時間

      注:不同字母表示差異顯著,相同字母表示差異不顯著,差異顯著性水平為0.05.

      加冰是目前市場上常用的梭子蟹運輸方法之一,但由圖1可見,其死亡速度最快,表明加冰運輸“只保鮮不?;睢?。這一點主要與溫度低有關(guān)。謝佳彥等[14]研究表明,梭子蟹較適宜于5 ℃干法運輸。林國雄等[15]認(rèn)為,溫度過低、溫差太大,蟹體適應(yīng)不了突然的環(huán)境而產(chǎn)生嚴(yán)重斷足,甚至死亡,降低成活率,建議采用梯度降溫冷卻麻醉處理。

      2.2 有水充氣和有水未充氣?;?/h3>

      死亡是一個終點事件,只表示活力為0時的生存狀態(tài)。而活力是一個過程變量,可以更好的動態(tài)描述梭子蟹生存狀況和分析致死原因。有水充氣?;詈陀兴闯錃獗;钏笞有坊盍ψ兓喜町惥薮?,前者活力保持較好,后者卻極差。有水充氣?;羁梢猿掷m(xù)保持著高活力,而有水未充氣?;罨盍囊婚_始就急速下降,其下降起始時間早于平均生存時間2.6 h(圖2),說明梭子蟹活力下降繼而死亡。有水充氣?;顓s未發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象,未出現(xiàn)普遍活力快速下降的現(xiàn)象。

      圖2 有水保活過程中三疣梭子蟹活力變化

      有水?;钍悄壳笆袌錾献畛S玫乃笞有繁;罘绞?,但有水?;畋仨毘錃?,以提供充足的溶解氧。劉重斌等[16]研究認(rèn)為三疣梭子蟹有水保活生存關(guān)鍵的溶解氧水平為2~4 mg/L。0、10、20 ℃的水中飽和溶解氧分別為14.64、11.26、9.08 mg/L,實際天然水中氧氣含量達(dá)不到上述飽和量。有水未充氣起始點溶解氧僅8 mg/L。隨著梭子蟹呼吸消耗氧氣,溶解氧會迅速下降。有水充氣保活溶解氧含量一直保持在9~11 mg/L(圖3),充足的氧氣避免了低氧脅迫和活力下降??梢姡芙庋踉谟兴;钪衅鹬陵P(guān)重要的作用。

      圖3 有水保活過程中水體溶解氧含量的變化

      2.3 離水干露

      梭子蟹離水后前4 h活力變化較為平穩(wěn),僅略微下降,類似于有水充氣?;睿? h后,活力快速下降,活力變化又類似于有水未充氣?;睢kx水干露平均生存時間7.6 h,活力下降之后陸續(xù)死亡(圖4)。

      梭子蟹靠鰓呼吸,雖然空氣中的氧氣含量21%(合300 mg/L),遠(yuǎn)高于水中的溶解氧含量,但梭子蟹無法直接利用空氣中的氧氣。氧氣必須先溶解于水中(或鰓體水中),再由蟹鰓呼吸利用。離水后蟹鰓中仍保留一定的水分,一定時間內(nèi)仍可提供氧氣,確保梭子蟹呼吸順暢。但鰓體中水分與有水保活量上的巨大差異,使得有水?;羁諝?氧)溶于水中的效率遠(yuǎn)不及直接溶于鰓體水中,這或許可解釋為什么有水未充氣?;钚Ч患半x水干露。但隨著離水干露時間的延長,蟹鰓中的水分排出,以及黏液、有機(jī)物等的附著,致使鰓絲黏著,有效氧氣的交換面積下降,對氧氣的有效利用減少,逐漸窒息死亡。如同有水未充氣?;睿x水干露后期導(dǎo)致低氧脅迫阻礙機(jī)體代謝能力,呼吸受阻,最終窒息死亡[17]。

      圖4 離水干露過程中三疣梭子蟹活力變化

      2.4 高氧?;?/h3>

      由圖1、表2可見,高氧?;钇骄鏁r間(38.4 h)顯著高于離水干露(7.6 h),活力快速下降的起始點(16 h)也遠(yuǎn)晚于離水干露(4 h),表明高含量氧氣有利于梭子蟹的?;?。這一點與何蓉等[18]的研究結(jié)果相一致,他們認(rèn)為充足的氧氣供應(yīng)是?;钸\輸?shù)那疤帷8哐跤欣诒3炙笞有份^高的活力和存活率,也從另一方面反映出梭子蟹離水后死亡與低氧脅迫有關(guān)。根據(jù)亨利定律高氧增加了氧分壓,意味著蟹鰓中可以溶解更多的氧氣。空氣中氧氣含量為21%,高氧?;顬?0%,如離水干露的梭子蟹鰓中溶解氧為8 mg/L,高氧環(huán)境理論上溶解氧應(yīng)為30 mg/L,很大程度上可抵消低氧脅迫。

      但是高氧保活后期還是發(fā)生了活力快速下降和死亡的現(xiàn)象(圖5)。由包裝盒內(nèi)氣體成分分析可知(圖6),隨著?;顣r間的延長,包裝盒內(nèi)的二氧化碳含量會持續(xù)上升。16 h后,二氧化碳含量達(dá)到3.5%時,活力開始快速下降。推測梭子蟹無水保活過程中不僅存在低氧脅迫,還存在高二氧化碳脅迫。

      2.5 高氧低二氧化碳?;?/h3>

      高氧低二氧化碳保活56 h后活力快速下降,比高氧?;钣盅娱L了40 h(圖7)。相對于平均生存時間53.1 h,也要晚2.9 h,表明死亡前未發(fā)生活力普遍下降的現(xiàn)象。其活力表現(xiàn)類似于有水充氣保活,而不同于離水干露、有水未充氣保活和高氧?;?。相對于高氧?;?,高氧低二氧化碳?;钸^程中CO2含量一直維持在極低的水平(圖8),避免了高二氧化碳脅迫,提高了?;钚Ч?。

      圖5 高氧保活過程中三疣梭子蟹活力變化

      圖6 高氧?;钸^程中氧氣/二氧化碳含量變化

      圖7 高氧低二氧化碳?;钸^程中三疣梭子蟹活力變化

      圖8 高氧低二氧化碳?;钸^程中氧氣/二氧化碳含量變化

      3 討 論

      3.1 低氧脅迫致死

      梭子蟹靠鰓呼吸,離水后鰓間仍保留一定的水分,短時間內(nèi)可提供充足的溶解氧供其正常呼吸,保持高活力和高存活率。但隨著離水時間的延長,一方面,伴隨著梭子蟹呼吸會不斷往體外排出水分,可利用的總?cè)芙庋鹾肯陆担硪环矫嬗捎陴ひ汉陀袡C(jī)物附著鰓絲致使有效氧交換面積下降,使梭子蟹呼吸窒息點逐漸上升而活力下降繼而死亡。這一現(xiàn)象被稱為低氧脅迫、或低氧窒息、或干露脅迫等。而低氧脅迫會導(dǎo)致內(nèi)臟損傷,如程民杰等[19]研究表明離水操作可能損傷了紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)的肝臟和腎臟,打破了體內(nèi)的平衡機(jī)制,代謝紊亂。姜娜等[17]發(fā)現(xiàn),干露脅迫導(dǎo)致三疣梭子蟹肝胰腺總抗氧化能力水平顯著下降。高氧?;羁梢匝娱L梭子蟹無水保活時間,主要是通過提高梭子蟹鰓中溶解氧含量,抵消離水干露窒息點上升而產(chǎn)生的低氧脅迫,以達(dá)到?;畹男Ч?/p>

      3.2 高二氧化碳脅迫致死

      高氧環(huán)境采用的密封包裝下還存在高二氧化碳脅迫,高含量二氧化碳加速梭子蟹活力下降繼而死亡。這一研究發(fā)現(xiàn)與King等[20]的有水?;钛芯拷Y(jié)果相類似,他們認(rèn)為魚在有水?;钸\輸中,需要特別關(guān)注二氧化碳含量,高于80 mg/L就會導(dǎo)致高碳酸血癥,呼吸障礙,昏迷,最終死亡。正常代謝活動所允許的最高二氧化碳含量為20~30 mg/L。高二氧化碳含量時,不論含氧量是否充足,魚體基本上仍處于昏迷死亡狀態(tài)[21]。目前還未見梭子蟹無水狀態(tài)二氧化碳脅迫閾值的報道。當(dāng)水面二氧化碳分壓力為0.098 MPa時,0、10、20 ℃的水中二氧化碳飽和溶解量分別為3350、2310、1690 mg/L,由于空氣中二氧化碳含量僅約0.03% (260 mg/L),與大氣二氧化碳相平衡,10 ℃時,水中二氧化碳僅為0.693 mg/L(2310×0.03%)。以80 mg/L計算,對應(yīng)的空氣中的二氧化碳含量為3.5%(80/2310),而此含量時高氧保活梭子蟹活力開始快速下降,繼而死亡(圖6)。采用高氧低二氧化碳?;畋苊饬说脱鹾透叨趸济{迫,是一種有效的無水?;罘椒?。

      低二氧化碳含量對梭子蟹活力無影響,超過傷害閾值的高二氧化碳含量會致死。而介于兩者之間的二氧化碳含量使梭子蟹休眠。目前有關(guān)魚類二氧化碳麻醉休眠正是利用這一特性,如二氧化碳麻醉休眠羅非魚[22]、鯽魚[23]、白斑狗魚[24](Esoxlucius)等,可以延長?;顣r間。

      3.3 其他致死因素

      適宜低溫有利于梭子蟹無水?;睿^低溫度或溫度驟降(如加冰)會產(chǎn)生低溫脅迫導(dǎo)致梭子蟹死亡。這一結(jié)果與彭婷等[25]認(rèn)為低溫脅迫致羅非魚昏迷及死亡的結(jié)果相類似。梭子蟹在低氧、高二氧化碳、低溫脅迫下死亡,其致死前活力普遍下降。而有水充氣?;詈透哐醯投趸急;?,避免了脅迫因素,?;顣r間相對較長,但仍然有限。隨著時間延長仍然會陸續(xù)死亡,其平均生存時間在活力快速下降之前,甚至不會出現(xiàn)活力快速下降的現(xiàn)象。因此,可推測梭子蟹還存在著其他致死因素,有待進(jìn)一步研究。

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