楊戰(zhàn)鋒 李曉勇 周百中 陳升陽 尚文俊

(鄭州大學第五附屬醫(yī)院肝膽胰腺外科，河南 鄭州 450052)

臨床對糖尿病的治療主要通過藥物或胰島素注射控制血糖水平，但并不能完全控制血糖及并發(fā)癥的發(fā)生。胰島細胞移植研究已有30多年，成為近年來治療胰島素依賴型糖尿病的一種很有前途的治療方法〔1～4〕。組織工程是結(jié)合生命、工程科學，以生物相容性良好的載體，與細胞結(jié)合而成的細胞-支架復(fù)合體，不但具有全新、獨特的組織結(jié)構(gòu)，而且仍然保持擁有生物活性，使復(fù)合體可應(yīng)用于多種組織或器官損傷的修復(fù)。本實驗采用在微重力環(huán)境下共培養(yǎng)大鼠胰島和辜丸支持細胞，形成胰島-睪丸支持細胞復(fù)合物，同時使其擁有內(nèi)分泌功能及免疫豁免特性。通過移植于糖尿病大鼠體內(nèi)，探討組織工程化胰腺的體外構(gòu)建及其在細胞移植中的實驗研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物 2月齡SD大鼠60只，其中8只用于睪丸組織細胞及胰島的分離，由軍事醫(yī)學科學院動物中心提供。實驗中對大鼠的處置符合國家標準〔5〕。

1.2主要試劑及設(shè)備 旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器(美國)，恒溫培養(yǎng)箱、無菌操作臺(上海一恒)，臺式冷凍高速離心機(日本)，BM-V型生物組織包埋機(北京佳源興業(yè)科技有限公司)，M199培養(yǎng)基(Sigma公司)，大鼠胰島素試劑盒、兔抗Fas-L抗體、小鼠抗胰島素單克隆抗體(上海藍基生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1SD大鼠胰島細胞的分離、純化與培養(yǎng) 取SD大鼠，注射戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，處死后打開腹腔，摘取完整胰腺組織，放于培養(yǎng)瓶中，37℃消化30 min，用解剖剪剪碎胰腺組織，加入0.5 mg/ml的膠原酶4 ml，37℃震蕩消化8 min，經(jīng)60目篩網(wǎng)過濾，置于預(yù)冷的Hank鹽溶液(含有滅活胎牛血清)終止消化。消化后，2 000 r/min低溫離心10 min，除去上清液，加入25% Dextran溶液，均勻后置于EP離心管中，然后依次加入25%、20%、10% Dextran溶液，然后2 000 r/min低溫離心10 min，吸取細胞層，立即用適量培養(yǎng)基潤洗2遍，得到的胰島中加入培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，于培養(yǎng)基中進行培育。

1.3.2支持細胞的分離、純化與培養(yǎng) 將1周齡大鼠麻醉后處死，75%乙醇滅菌后，于腹股溝處解剖，摘取大鼠睪丸組織，輕輕除去附睪和脂肪，稱重，置于預(yù)冷的Hank鹽溶液中，慢慢剝離外層白膜，用解剖剪將睪丸剪成糊狀，加入1 mg/ml膠原酶溶液，37℃震蕩消化8 min，過200目篩網(wǎng)過濾，置于預(yù)冷的Hank鹽溶液(含有滅活胎牛血清)中終止消化。1 500 r/min低溫離心10 min，輕輕吸去上清液，加入0.5 mol/L低滲緩沖液1 ml，靜置1 min，1 500 r/min低溫離心5 min，吸去上清液，加入M199培養(yǎng)基(含10%體積分數(shù)滅活胎牛血清)，混勻后接種培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，觀察貼壁情況，及時除去未貼附細胞，培養(yǎng)1 d后，加入0.5 mol/L低滲緩沖液3 ml處理5 min，純化細胞。

1.3.3細胞復(fù)合體的制備和檢測 取純化的2 000 IEQ胰島與5.0×106原代睪丸支持細胞接種共培養(yǎng)于旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器中，以20 r/min為初始速度，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，隨著支持細胞-胰島復(fù)合物的增大，逐步提高旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)速。分別取細胞復(fù)合物進行DTZ染色及HE染色，于光鏡下觀察其形態(tài)學。同時，以同樣方法培養(yǎng)胰島、原代睪丸支持細胞作為對照組。

1.3.4糖尿病大鼠模型的建立及細胞復(fù)合物移植 建模方法參考文獻〔6〕。取SD雄性大鼠，禁食12 h后，以體質(zhì)量6 mg/100 g腹腔注射50 mg/ml鏈脲佐菌素檸檬酸鈉溶液，連續(xù)腹腔注射5 d，每日檢測血糖變化，當連續(xù)7 d檢測大鼠血糖>16.7 mmol/L時，表明大鼠糖尿病建模成功。將模型大鼠禁食12 h后，乙醚麻醉后于大鼠腎被膜下移植復(fù)合物(胰島量為2 000 ICQ/只)。采用同樣方法將新鮮胰島、單獨培養(yǎng)的胰島，睪丸支持細胞分別移植入模型大鼠作為移植對照組，未移植模型大鼠作為空白對照組。

1.3.5移植后各組大鼠血糖監(jiān)測及葡萄糖耐受實驗 各組移植后，經(jīng)大鼠尾靜脈采血，1次/2 d，監(jiān)測各組大鼠血糖水平：(1)血糖連續(xù)2次均<7.0 mmol/L為正常；(2)血糖連續(xù)2次均>11.4 mmol/L為糖尿病復(fù)發(fā)。對血糖恢復(fù)正常并保持20 d的大鼠，禁食8 h后進行葡萄糖耐受試驗，按體質(zhì)量200 mg/100 g腹腔內(nèi)注射25%葡萄糖溶液，每15 min檢測1次血糖(檢測至2 h)。

1.3.6移植物檢測與鑒定 移植后，檢測各組大鼠血糖水平，摘取血糖30 d以上保持正常水平的大鼠腎臟組織，清洗后，用Bouin溶液固定，包埋、切片，進行HE染色，顯微下觀察，并進行Fas-L、胰島素免疫組化法染色，對大鼠移植物進行鑒定。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1胰島形態(tài)學檢測結(jié)果 摘取SD大鼠胰島組織，經(jīng)化學方法純化，顯微鏡下觀察結(jié)果顯示：胰島細胞團結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，可見胰島被膜，染色后顏色顯示豐富，表明實驗純化得到的胰島純度很高。采用DTZ特異性染色分離純化得到的胰島呈不透光的鮮紅色。見圖1。

圖1 胰島細胞團形態(tài)學檢測結(jié)果

2.2睪丸支持細胞形態(tài)學檢測結(jié)果 睪丸細胞貼壁后于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細胞基本已全部貼壁生長，細胞立體感較強，顯微鏡下可見極少量球形精細胞貼附于睪丸細胞上，經(jīng)臺盼籃染色后活細胞透亮，總數(shù)占95%以上，少數(shù)死細胞染成藍色。HE染色可見細胞生長旺盛，形態(tài)呈寬大柱狀或纖維樣，排列緊密，多個同時存在時融合成片，界限不清，呈單層膜狀，一般有3～4個突起，突起相互連接，胞質(zhì)鋪展較大，可見有多量大小不一的空泡狀結(jié)構(gòu)。見圖2。

2.3支持細胞-胰島復(fù)合物形態(tài)學檢測結(jié)果 培養(yǎng)24 h后，睪丸支持細胞-胰島球形細胞復(fù)合物逐步形成。培養(yǎng)5 d后，細胞復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且致密，HE染色后，顯微鏡下可見細胞復(fù)合物呈球形，且無壞死細胞；DTZ染色后顯微鏡下可見復(fù)合物被支持細胞包裹；Fas-L免疫組織切片染色后，可見在整個細胞復(fù)合物中，支持細胞呈陽性，胰島素陽性的β細胞檢測結(jié)果與透射電鏡觀察結(jié)果一致，結(jié)果顯示共培養(yǎng)的胰島生長狀態(tài)相對較好。見圖3。

圖2 睪丸支持細胞形態(tài)學檢測結(jié)果

圖3 支持細胞-胰島復(fù)合物采用不同染色檢測結(jié)果(×100)

2.4移植后模型大鼠血糖檢測結(jié)果 移植后3 d血糖恢復(fù)正常，其保持正常血糖水平均超過30 d；僅接受胰島移植(經(jīng)過生物反應(yīng)器培養(yǎng))的模型SD大鼠，在移植后4 d血糖水平也達到正常，但僅保持10 d后，血糖水平又逐漸升高，并出現(xiàn)SD大鼠相繼死亡的現(xiàn)象。移植新鮮胰島的模型SD大鼠，2～3 d內(nèi)血糖恢復(fù)正常，但維持在正常血糖水平僅4 d。接受睪丸支持細胞移植的模型SD大鼠，移植后未出現(xiàn)血糖下降，大鼠因高血糖而相繼死亡。未接受移植的模型SD大鼠血糖水平始終較高，且模型大鼠相繼死亡較快。移植睪丸支持細胞-胰島細胞復(fù)合物的正常SD大鼠，移植前后大鼠血糖水平無顯著變化，且沒有出現(xiàn)低血糖水平。從血糖水平結(jié)果總結(jié)，微重力環(huán)境下共培養(yǎng)睪丸支持細胞-胰島細胞復(fù)合物能夠提高胰島的活性，降低其免疫原性，與接受新鮮胰島移植的SD大鼠相比，復(fù)合物移植使模型大鼠保持血糖正常的時間明顯更久。見圖4。

2.5移植物HE染色及免疫組化染色結(jié)果 大鼠解剖后，摘取腎臟組織，HE染色可見睪丸支持細胞-胰島細胞復(fù)合物移植組模型大鼠腎被膜下有明顯的移植物存在，未發(fā)現(xiàn)明顯的淋巴細胞浸潤。胰島素免疫染色和Fas-L染色均可見陽性細胞的存在。僅接受胰島移植(經(jīng)過生物反應(yīng)器培養(yǎng))的模型SD大鼠的腎被膜被淋巴細胞明顯浸潤。見圖5，圖6。

圖4 移植后模型大鼠血糖檢測結(jié)果

2.6移植后SD大鼠葡萄糖耐受實驗 接受睪丸支持細胞-胰島細胞復(fù)合物移植后的模型SD大鼠，在基本保持正常血糖水平均超過30 d后，進行葡萄糖耐受實驗。移植睪丸支持細胞-胰島細胞復(fù)合物的模型大鼠體內(nèi)胰島對葡萄糖仍保持明顯的敏感性，與正常組大鼠葡萄糖的耐受能力相比，復(fù)合物移植組大鼠平均血糖基本在2 h內(nèi)可以恢復(fù)正常，與正常檢測結(jié)果接近。見圖7。

圖6 移植有睪丸支持細胞-胰島細胞復(fù)合物的腎組織免疫組化檢測結(jié)果(×200)

圖7 葡萄糖耐受實驗檢測不同時間點血糖水平(mmol/L)

3 討 論

獲得高純度的胰島是胰島移植治療成果的關(guān)鍵。分離、純化胰島的方法有很多，但都有各自的優(yōu)缺點，如機械剪切分離法、膠原酶消化法、自動機械分離法等〔7～10〕。睪丸支持細胞是生殖系統(tǒng)的重要組成部分。離體的胰島細胞團只有在一定的微環(huán)境下才能保證其正常功能狀態(tài)?？膳c胰島細胞團共培養(yǎng)的細胞有很多，如小腸黏膜細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等，但都對胰島細胞的 存活有一定的促進作用〔11，12〕。本研究胰島與辜丸支持細胞接種后共培養(yǎng)，結(jié)果顯示共培養(yǎng)的胰島生長狀態(tài)相對較好。葡萄糖耐受實驗顯示，移植睪丸支持細胞-胰島細胞復(fù)合物的模型大鼠體內(nèi)胰島對葡萄糖仍保持明顯的敏感性。實驗結(jié)果提示：微重力環(huán)境下培養(yǎng)睪丸支持細胞-胰島細胞可以提高胰島在移植體內(nèi)的活性，降低其免疫原性，同時保持良好的胰島素分泌功能及對葡萄糖的敏感性，并且存活時間保持較長。

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