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      子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

      2018-03-20 01:39:48肖曉霞夏親華
      關(guān)鍵詞:嚙齒類動(dòng)物狒狒靈長類

      肖曉霞,夏親華

      (1.南京中醫(yī)藥大學(xué),南京 210023;2.江蘇省中醫(yī)院,南京 210029)

      子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis,EMs)簡稱內(nèi)異癥,是指子宮內(nèi)膜組織腺體和間質(zhì)在子宮腔被覆內(nèi)膜及子宮以外的部位生長的雌激素依賴性婦科疾病[1]。該病發(fā)病機(jī)制不清,手術(shù)和藥物治療遠(yuǎn)期療效欠佳,術(shù)后復(fù)發(fā)率高。動(dòng)物模型在研究本病的發(fā)生發(fā)展、病理生理及治療等方面有著重要的作用。研究者自上世紀(jì)20年代建立第1例家兔自體移植EMs模型以來,EMs動(dòng)物模型經(jīng)歷了從自發(fā)到誘導(dǎo)、從有創(chuàng)到無創(chuàng)、從在體到離體的發(fā)展,現(xiàn)已日趨成熟。目前,靈長類和嚙齒類動(dòng)物模型研究為普遍,現(xiàn)將這2種動(dòng)物模型研究進(jìn)展綜述如下。

      1 靈長類動(dòng)物模型

      EMs發(fā)病機(jī)制的主導(dǎo)理論是Sampson[2]在1921年提出的經(jīng)血逆流種植學(xué)說,即脫落的子宮內(nèi)膜組織(腺上皮和間質(zhì))隨經(jīng)血倒流,種植在盆腹腔臟器引起。靈長類動(dòng)物具有與人類相似的盆腔解剖結(jié)構(gòu)和生殖生理特點(diǎn),其有規(guī)律的月經(jīng)周期并能自發(fā)形成EMs,是研究EMs發(fā)病機(jī)制、病理生理及治療的最佳選擇。靈長類動(dòng)物模型包括自發(fā)性和誘發(fā)性2種。

      1.1 自發(fā)性Ems 自發(fā)性Ems在獼猴[3]、狒狒[4]和帶尾纖獼猴[5]中均有報(bào)道。1975年,MacKenzie等[3]在尸檢一只獼猴時(shí)發(fā)現(xiàn)獼猴盆腔內(nèi)有充滿灰色或巧克力色液體的囊腫,主要累及卵模型自發(fā)性巢、子宮韌帶、子宮漿膜以及膀胱和末端結(jié)腸的腹膜表面。鏡下顯示病變由子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)組成并伴有不同程度的纖維化。1991年,D’Hooghe等[4]用腹腔鏡檢查首次證明自發(fā)性EMs發(fā)生在靈長類動(dòng)物狒狒懷孕期間,且病理學(xué)組織結(jié)構(gòu)特征與人類相似。自發(fā)性靈長類動(dòng)物模型發(fā)病機(jī)制和病理生理特征與人類最相似,是最理想的模型。但自發(fā)性形成EMs成模率低、周期長、難以在實(shí)驗(yàn)中推廣。

      1.2 誘發(fā)性模型 現(xiàn)有的誘發(fā)性模型主要是通過暴露于危險(xiǎn)因素或手術(shù)來誘導(dǎo),包括單獨(dú)的重復(fù)性外科手術(shù),閉鎖靈長類動(dòng)物子宮頸、陰道口以增加逆行經(jīng)血量,藥物以及手術(shù)自體移植等。

      1.2.1 單獨(dú)的重復(fù)性外科手術(shù) 2012年,Harirchian等[6]發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的重復(fù)性外科手術(shù)可誘導(dǎo)自發(fā)性EMs。實(shí)驗(yàn)組雌性狒狒(n = 9)在月經(jīng)第2天腹膜內(nèi)接種自體月經(jīng)子宮內(nèi)膜進(jìn)行2個(gè)連續(xù)月經(jīng)周期的實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)。對(duì)照組狒狒(n = 5)沒有接種,但在相同的時(shí)間點(diǎn)接受診斷性腹腔鏡檢查。診斷性腹腔鏡檢查在第2次接種后1、3、6、9和12個(gè)月的第8~12天排卵后進(jìn)行,第15個(gè)月時(shí)進(jìn)行尸體解剖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沒有接種的情況下,對(duì)照組狒狒均發(fā)生自發(fā)性EMs。

      1.2.2 閉鎖子宮頸、陰道口,增加逆行經(jīng)血量 1953年,Scott[7]將恒河猴子宮頸遠(yuǎn)端切除,近端子宮移至前腹壁,在為期第75~963天的檢測周期中,該研究中使用的10只恒河猴有5只出現(xiàn)了EMs。1994年,D'Hooghe等[8]采用將硅膠插入宮頸管(n = 1),電凝加宮頸口縫合(n = 4)和宮頸上部結(jié)扎(n = 2)等方法阻塞宮頸,導(dǎo)致狒狒的逆行月經(jīng)量增加,3個(gè)月內(nèi),7個(gè)狒狒均發(fā)生EMs。

      1.2.3 藥物誘導(dǎo) 1993年,Rier[9]在1項(xiàng)為期15年的研究中發(fā)現(xiàn),化學(xué)毒物二惡英(TCDD)的慢性暴露與獼猴EMs發(fā)生率有關(guān),且疾病的嚴(yán)重程度與給藥劑量呈正相關(guān),相較于7只暴露于25 ppt二惡英(71%)的獼猴中有5只發(fā)展為中至重度EMS,7只暴露于5 ppt二惡英(43%)的獼猴僅有3只發(fā)展為中至重度EMS。2016年,國內(nèi)亦有研究[10]報(bào)道,米索前列醇探索性成功誘導(dǎo)成熟雌性恒河猴形成子宮腺肌病,連續(xù)6個(gè)月每天經(jīng)陰道給予恒河猴米索前列醇1次,而后對(duì)動(dòng)物行全子宮及左側(cè)附件切除,在大體標(biāo)本中可見輸卵管系膜有2處紫褐色顆粒狀結(jié)節(jié),病理組織切片顯示子宮結(jié)構(gòu)肌層紊亂,子宮內(nèi)膜腺體突破基底層向肌層延伸。

      誘發(fā)性靈長類動(dòng)物模型較自發(fā)性模型具有實(shí)驗(yàn)周期短、成模率高的明顯優(yōu)勢,并能進(jìn)行多次手術(shù)操作,但部分靈長類動(dòng)物為保護(hù)動(dòng)物,數(shù)量有限且價(jià)格昂貴,不適宜用于科學(xué)研究。

      1.2.4 手術(shù)移植 1950年,TeLinde等[11]建立第1例非人靈長類動(dòng)物恒河猴自體移植EMs模型,將手術(shù)獲得的子宮內(nèi)膜片段移植到恒河猴前后穹窿、卵巢、闊韌帶、腸壁和腹壁,在隨后第26~522天的檢測中,6只猴子均成功建立內(nèi)異癥模型。2013年,Donnez等[12]研發(fā)了第1例誘導(dǎo)深部結(jié)節(jié)性EMs的狒狒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,移植的碎片分為單獨(dú)的子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜加子宮內(nèi)膜-子宮肌層交界區(qū)(JZ)、完整子宮組織和無子宮內(nèi)膜的深肌層4組,分別移植到Douglas囊、左右髂窩、直腸前壁、覆蓋右側(cè)肩胛窩的腹膜上。20~24周后,取異位病灶并在顯微鏡下觀察,結(jié)果顯示移植含有JZ的標(biāo)本誘發(fā)的結(jié)節(jié)性病變明顯較大且腺體密度大。

      2 嚙齒類動(dòng)物模型

      大鼠和小鼠等嚙齒類動(dòng)物繁殖力強(qiáng),動(dòng)情周期短,實(shí)驗(yàn)可操作性強(qiáng)。嚙齒類動(dòng)物模型是目前研究EMs的最常用模型。因鼠類不能自發(fā)形成異位病灶,研究者常采用手術(shù)移植或腹腔內(nèi)注射子宮內(nèi)膜、子宮片段、蛻膜、月經(jīng)血等來誘導(dǎo)內(nèi)異癥的發(fā)生。目前,嚙齒類動(dòng)物模型包括K-ras基因激活小鼠自發(fā)性EMs、同種移植和異種移植3類。

      2.1 K-ras基因激活小鼠自發(fā)性Ems 2005年,Dinulescu[13]建立首例小鼠自發(fā)性EMs模型,將表達(dá)Cre重組酶(AdCre)的重組腺病毒載體注射到loxPStop-loxP-K-rasG12D/+(LSL-K-rasG12D/+)小鼠卵巢囊中來激活致癌K-ras基因,導(dǎo)致卵巢子宮內(nèi)膜樣病變。在AdCre注射后約8個(gè)月,除了卵巢發(fā)生子宮內(nèi)膜樣病變,47%的小鼠(n = 15)也發(fā)生腹膜內(nèi)EMs,這是目前唯一1例報(bào)道的自發(fā)性小鼠EMs。

      2.2 同種移植 同種移植包括自體移植和同種異體移植,手術(shù)切取雌性SpragueDawley大鼠[14-15]、Wistar大鼠[16-18]、BALB/c小鼠[19]的子宮角,或腹腔內(nèi)注射懸浮的子宮內(nèi)膜片段[19]或分離子宮肌層[15-16]或?qū)拥膬?nèi)膜組織[14]直接手術(shù)縫合到受體皮下、腹壁、腸系膜、結(jié)直腸等部位。常用的組織塊大小在從2~5 mm之間[20-23]。1985年,Vernon[24]等通過手術(shù)誘導(dǎo)第1例大鼠自體EMs。此后該模型被廣泛應(yīng)用,但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在需要多次開腹易死亡,難以對(duì)移植物實(shí)施實(shí)時(shí)監(jiān)控等問題。目前,研究者利用現(xiàn)有的影像學(xué)技術(shù)、熒光標(biāo)記、基因轉(zhuǎn)染及熒光轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等手段,實(shí)現(xiàn)對(duì)EMs動(dòng)物的活體無創(chuàng)觀察。通過Gadofosveset-Trisodium增強(qiáng)型核磁共振[25]、光聲顯微鏡(PAM)[26]、核素顯像[27]等成像方法實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)時(shí)無創(chuàng)觀察,為進(jìn)一步的臨床推廣提供了前期的研究基礎(chǔ),但多數(shù)研究處于探索階段,應(yīng)用尚不廣泛且費(fèi)用昂貴。Wang[28]將表達(dá)轉(zhuǎn)基因螢光素酶的CMV-Luc小鼠子宮內(nèi)膜組織移植到NOD-SCID小鼠腹壁,使用非侵入性體內(nèi)成像系統(tǒng)監(jiān)測實(shí)驗(yàn)性EMs的發(fā)展。在干預(yù)期間,每周通過測量皮下熒光素酶報(bào)告基因的生物發(fā)光來監(jiān)測子宮內(nèi)膜異位病變的生長。利用表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠建立同種異體移植EMs模型[29]已普遍開展。但GFP熒光常隨著時(shí)間延長減弱,且種植于腹腔深處觀察效果較皮下欠佳。而增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和表達(dá),其構(gòu)建的EMs模型[30]更具優(yōu)勢,適用于腹腔深處的觀察。

      嚙齒類動(dòng)物來源廣泛,容易獲得,實(shí)驗(yàn)成本低,同種移植模型穩(wěn)定可復(fù)制,已在EMs的各種相關(guān)研究中廣泛開展。但目前的研究在動(dòng)物品種、移植物是否為單純的內(nèi)膜組織、動(dòng)物是否切除卵巢接受外源性激素支持等問題上尚未統(tǒng)一,且嚙齒類動(dòng)物與人存在種屬差異,其研究結(jié)果未必適用于臨床。

      2.3 異種移植 異種移植是指將EMs或非EMs的人來源子宮內(nèi)膜組織移植到免疫缺陷鼠體內(nèi)。目前常用的動(dòng)物有先天性T淋巴細(xì)胞免疫缺陷裸鼠、先天性T、B淋巴細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷SCID鼠及先天性T、B淋巴細(xì)胞和部分NK細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷NOD/SCID鼠。其中最常用的是裸鼠,但在裸鼠體內(nèi)人子宮內(nèi)膜組織成活率較SCID/NOD-SCID鼠低,其模型適用于3周以內(nèi)實(shí)驗(yàn)周期較短的研究[31]。Stocks等[32]手術(shù)切除裸鼠卵巢,皮下植入緩釋雌二醇膠囊,將人子宮內(nèi)膜組織片段注射入裸鼠腹腔內(nèi),成功建立了人源性裸鼠EMs模型。Liu等[33]采用腺病毒編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Ad-eGFP)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞(組1)、子宮內(nèi)膜組織片段(組2),將Ad-eGFP轉(zhuǎn)染的組1與組2子宮內(nèi)膜片段懸液注射到裸鼠皮下,使用熒光立體顯微鏡對(duì)動(dòng)物進(jìn)行成像觀察。實(shí)驗(yàn)證實(shí)組1的裸鼠模型陽性率較高,熒光成像持續(xù)時(shí)間較長,病灶重量較大。

      異種移植能保留人類內(nèi)膜組織的生物學(xué)特性,避免了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人之間的種屬差異,是較理想的選擇。但移植物存活時(shí)間較短,實(shí)驗(yàn)小鼠免疫缺陷無法進(jìn)行免疫相關(guān)的研究,移植物常需要外源性激素支持生長,而EMs作為激素依賴性疾病,應(yīng)用激素可能潛在的引起全身性變化,從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

      3 小結(jié)

      EMs對(duì)育齡期女性帶來了心理和生理的雙重負(fù)面影響,不斷升高的發(fā)病率迫切要求我們找到理想的研究該疾病的動(dòng)物模型。理想的動(dòng)物模型要求能反應(yīng)疾病的本質(zhì),研究結(jié)果對(duì)臨床實(shí)踐具有指導(dǎo)意義。EMs免疫缺陷小鼠模型的成功構(gòu)建消除了動(dòng)物與人類子宮內(nèi)膜種屬起源的差異性,人子宮內(nèi)膜仍保留人類內(nèi)膜固有的生物學(xué)特性。近年來有學(xué)者將人子宮內(nèi)膜和人外周血淋巴細(xì)胞聯(lián)合種植到SCID鼠體內(nèi),成功構(gòu)建人免疫系統(tǒng)EMs模型,該模型既保持了人子宮內(nèi)膜原有的生化特征也具有免疫功能,具有獨(dú)特的優(yōu)勢。但限于倫理學(xué)問題,該模型采用的并非患者同源的血液,故應(yīng)用該模型的研究結(jié)果未必能準(zhǔn)確反應(yīng)內(nèi)異癥的疾病本質(zhì)。如能建立患者同源性免疫系統(tǒng)EMs模型將為EMs的研究翻開新篇章。

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