王杰欽 游輔宇 彭青 高毅

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院肝膽二科，器官衰竭防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州 510282）

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在全球所有惡性腫瘤相關(guān)死因中高居第二位［1］。原發(fā)性肝癌主要包括肝細(xì)胞癌（hepatocellular carci?noma）、肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma）和肝細(xì)胞癌-肝內(nèi)膽管癌混合型3種不同病理類型，其中肝細(xì)胞癌占到85%～90%以上［2］。原代肝癌細(xì)胞培養(yǎng)可使肝癌細(xì)胞最大程度地保持其在體內(nèi)的各種生物學(xué)特性，有利于對肝癌的發(fā)病機(jī)制及其防治進(jìn)行深入的研究。目前國內(nèi)外尚無相關(guān)的綜述，本文在此主要針對肝細(xì)胞癌，對其原代培養(yǎng)的過程、方法及相關(guān)培養(yǎng)條件進(jìn)行簡要介紹，以期為后續(xù)的基礎(chǔ)及臨床研究做好鋪墊。

1 取材及預(yù)處理

腫瘤組織主要來源于肝癌患者手術(shù)切除的標(biāo)本或細(xì)針穿刺活檢的標(biāo)本，并且要求患者未接受過任何抗腫瘤治療。對于手術(shù)切除的肝癌標(biāo)本，應(yīng)從瘤體生長活躍、無壞死變性的邊緣部位多點(diǎn)取材。取下的標(biāo)本須立即放入冰浴的培養(yǎng)基中，并盡快送至實(shí)驗(yàn)室處理。文獻(xiàn)［3］建議熱缺血時(shí)間不應(yīng)超過20 min，而冷缺血時(shí)間最好控制在1 h以內(nèi)。另外，在進(jìn)行分離之前應(yīng)先將標(biāo)本上的血塊、壞死組織以及結(jié)締組織剪掉，用培養(yǎng)基漂洗數(shù)次。細(xì)針穿刺活檢的標(biāo)本則可以通過反復(fù)離心和重懸靜置的方法盡可能除去血細(xì)胞［4］。有一點(diǎn)需注意的是，不論是何種標(biāo)本，取材均應(yīng)在不影響病理診斷的前提下進(jìn)行，且事先應(yīng)征得患者及醫(yī)院倫理委員會同意。

2 分離方法

2.1 機(jī)械法 最常用的為剪碎法。此法直接將組織剪碎成約1 mm3的小塊，然后轉(zhuǎn)入T25培養(yǎng)瓶中，加入少量含10%～20%胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)液或DMEM培養(yǎng)液，倒置貼附2～3 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞爬出［4-9］。

日本岡山大學(xué)MATSUURA［7］通過腹腔鏡穿刺活檢及組織塊培養(yǎng)，從3例肝硬化患者身上成功構(gòu)建出1株肝癌細(xì)胞系，細(xì)胞活率在90%以上，且24 h貼壁率為90%，該細(xì)胞系在起初的5個(gè)月內(nèi)一直維持其細(xì)胞形態(tài)而無任何增殖表現(xiàn)。高雄醫(yī)學(xué)大學(xué)附設(shè)中和紀(jì)念醫(yī)院林子堯等［4］用超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺獲得的肝癌標(biāo)本進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，結(jié)果15例中共成功培養(yǎng)6例，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)3代后生長穩(wěn)定并用于進(jìn)一步的藥敏試驗(yàn)。羅馬尼亞TOMULEASA等［6］對1例肝癌手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，2周后團(tuán)塊周邊出現(xiàn)散在的單個(gè)細(xì)胞，到第3周細(xì)胞即呈單層貼壁生長，細(xì)胞活率＞80%，該細(xì)胞隨后被成功用于腫瘤干細(xì)胞的研究。復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院高強(qiáng)等［5］對55份來源于10例乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌的標(biāo)本進(jìn)行組織塊培養(yǎng)及多區(qū)域測序，發(fā)現(xiàn)了廣泛的瘤內(nèi)異質(zhì)性（intratumor heterogeneity），并由此建立了一套基于基因檢測的化療藥物敏感性預(yù)測模型，而其獲得低傳代細(xì)胞所需時(shí)間大致為1個(gè)月［5］。

廣東醫(yī)學(xué)院林滿洲等［10］采用組織薄片法進(jìn)行原代肝癌細(xì)胞培養(yǎng)，不同之處在于其并非將組織剪碎，而是利用固定在一起的兩塊手術(shù)刀片的間距切取組織薄片。該法在培養(yǎng)成功率、細(xì)胞爬出時(shí)間及肝癌特異性標(biāo)記物GPC3的表達(dá)上與傳統(tǒng)的組織塊培養(yǎng)法并無顯著差異，但薄片法培養(yǎng)的細(xì)胞在形態(tài)及潔凈程度上較組織塊法好。

2.2 酶消化法 包括膠原酶消化法和胰酶消化法。膠原酶又稱為膠原蛋白水解酶，能特異性地水解結(jié)締組織中膠原纖維天然存在的三維螺旋結(jié)構(gòu)而對細(xì)胞無明顯損傷［11］。胰酶（指胰蛋白酶）主要用于分解組織間質(zhì)蛋白，但對細(xì)胞膜也有較強(qiáng)的破壞作用。盡管膠原酶價(jià)格昂貴，但由于其作用溫和、消化后細(xì)胞活率高而被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物及人肝細(xì)胞的分離，以下主要介紹膠原酶消化法。

膠原酶消化法首先也是將組織剪成1 mm3左右的小塊，然后加入適宜濃度（0.05%～0.10%）的膠原酶（Ⅱ型或Ⅳ型）37℃下消化一定時(shí)間（從20 min至1 h不等），再用篩網(wǎng)或紗布過濾，反復(fù)低速離心，最后重懸即可［12-15］。

DOUMBA等［12］采用0.1%的Ⅳ型膠原酶對11例早期肝癌合并肝硬化的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行原代培養(yǎng)，平均產(chǎn)量可達(dá)7×106，細(xì)胞活率與純度分別為90%與85%。國內(nèi)昆山市第一人民醫(yī)院的陳敏斌等［13］用Ⅰ型膠原酶消化30 min，從8例原發(fā)性肝癌標(biāo)本中成功培養(yǎng)2株細(xì)胞系，并對KU?0060648的抑瘤機(jī)制進(jìn)行了深入研究。浙江省人民醫(yī)院王震等［14］將消化時(shí)間延長至1 h，結(jié)果2例標(biāo)本均培養(yǎng)成功，第3代至第10代的細(xì)胞被用于后續(xù)mTOR激酶抑制劑CZ415的研究。第二軍醫(yī)大學(xué)的黎江［15］采用0.05%的Ⅰ型膠原酶及優(yōu)化的新型無血清培養(yǎng)基，對腫瘤組織直接進(jìn)行消化培養(yǎng)，獲得2株肝癌干細(xì)胞樣的球狀細(xì)胞系，在連續(xù)傳代7代后生長趨于穩(wěn)定，約4 d傳一代。同時(shí)，他們通過異種移植成功構(gòu)建了人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，反復(fù)傳代至第5代后取出進(jìn)行培養(yǎng)，亦成功培養(yǎng)1株呈上皮狀生長的人肝癌細(xì)胞系和1株肝癌干細(xì)胞樣的球狀細(xì)胞系，后者連續(xù)傳代8代后生長趨于穩(wěn)定，約4 d傳一代。

3 細(xì)胞的純化

3.1 低速離心法 由于肝細(xì)胞密度大于非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，可以通過反復(fù)低速離心（50～100g離心3～5 min，重復(fù)3～5次）收集到絕大多數(shù)肝細(xì)胞。此法常用于動(dòng)物及人肝細(xì)胞的純化，有研究顯示其純化效果與Percoll密度梯度離心法接近，但耗時(shí)更短、成本更低、操作簡單。

3.2 密度梯度離心法 其原理主要是利用細(xì)胞之間的比重差異對不同細(xì)胞進(jìn)行分層純化，目前應(yīng)用較廣的分離液有 Percoll和 Ficoll?Hypaque。Percoll是一種表面包被聚乙酰吡咯烷酮的硅膠顆粒，由于其擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外它不穿透生物膜，對細(xì)胞無毒害作用，因此廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。因?yàn)楦缓盍Φ母渭?xì)胞密度范圍為1.08～1.09 g/mL，而受損的肝細(xì)胞、非實(shí)質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞碎片的密度均在1.07 g/mL以下，故可以采用40%～50%的Percoll分離液進(jìn)行純化。也有學(xué)者推薦采用25%的Percoll分離液［16-17］。Ficoll?Hypaque是蔗糖的多聚體，呈中性，也不穿透生物膜。北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院的張志謙等采用Ficoll?Hypaque密度梯度離心法（75%/100%）對原代肝癌細(xì)胞與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)，并首次證實(shí)免疫療法對復(fù)發(fā)性肝癌中的干細(xì)胞樣細(xì)胞具有靶向作用［18］。

3.3 胰蛋白酶消化法 適用于成纖維細(xì)胞多而旺盛、貼壁較好，而腫瘤細(xì)胞量少、貼壁能力較差時(shí)［11］。大致流程為向PBS沖洗后的培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，顯微鏡下觀察當(dāng)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞脫落而成纖維細(xì)胞尚未脫落時(shí)終止消化，收集上清離心即可得較純化的腫瘤細(xì)胞。事實(shí)上，實(shí)際操作中經(jīng)常聯(lián)合使用幾種純化方法來達(dá)到最佳的純化效果，所以沒有必要拘泥于某一種具體的方法。

4 肝癌細(xì)胞的鑒定

目前病理診斷常用的肝細(xì)胞癌標(biāo)志物有肝細(xì)胞石蠟抗原-1（hepatocyte paraffin antigen 1，Hep Par?1）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican?3，GPC?3）、CD34、多克隆性癌胚抗原（polyclonal carcinoembryonic antigen，pCEA）、CD10、精氨酸酶-1（arginase?1，Arg?1）、甲胎蛋白（α?fetoprotein，AFP）等［19］。

Hep Par?1是1993年WENNERBERG等［20］以石蠟包埋的肝組織內(nèi)線粒體作為抗原克隆出的一種新的單克隆抗體，在肝細(xì)胞源性腫瘤中陽性率較高，但無法鑒別腫瘤的良惡性。GPC?3由PILIA等［21］于1996年首先描述，屬于硫酸類肝素糖蛋白聚糖家族中的一員，通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）結(jié)合于細(xì)胞表面。GPC?3在人體胚胎期的胎盤、胚肝、胚肺及胚腎等組織中呈高表達(dá)，而成人僅在肺和卵巢等少數(shù)組織有低表達(dá)，正常肝組織未見表達(dá)［22］。GPC?3對肝細(xì)胞癌的診斷具有很高的特異性，且不受腫瘤分化程度的影響，但其敏感性欠佳［23］。Arg?1是一種雙核含錳金屬酶，在肝臟中高表達(dá)，可將精氨酸代謝為鳥氨酸和尿素，進(jìn)而參與尿素循環(huán)，對體內(nèi)氨解毒起重要作用［24］。Arg?1是一種非常敏感的肝細(xì)胞癌標(biāo)志物，但它同樣不能區(qū)別肝細(xì)胞源性腫瘤的性質(zhì)。AFP為肝癌細(xì)胞返祖性合成的一種高分子質(zhì)量胚胎蛋白，目前仍是臨床上最常用的診斷原發(fā)性肝癌的血清標(biāo)志物［2］，其特異性很強(qiáng)但敏感性較低。

以上幾種肝細(xì)胞癌標(biāo)志物的比較如下：敏感性：Arg?1＞GPC?3＞Hep Par?1＞AFP；特異性：AFP＞GPC?3＞Hep Par?1＞Arg?1；陽性預(yù)測值：AFP＞GPC?3＞Arg?1＞Hep Par?1；陰性預(yù)測值：GPC?3＞Arg?1＞AFP＞Hep Par?1［24］?？梢?，聯(lián)合檢測Arg?1和GPC?3對肝癌細(xì)胞的鑒定具有極高的敏感性和特異性，有助于提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5 培養(yǎng)基的選擇

現(xiàn)有的報(bào)道基本上都采用DMEM、RPMI?1640和Williams′E 3種培養(yǎng)基。DMEM和RPMI?1640廣泛用于各種原代細(xì)胞的培養(yǎng)，而Williams′E是肝細(xì)胞專用培養(yǎng)基。其他如無血清培養(yǎng)基HepatoZYME?SFM也常用于原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)，但鮮有用于原代肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)。有研究顯示W(wǎng)illiams′E相較于其他幾種培養(yǎng)基更適合于原代肝細(xì)胞的短期培養(yǎng)［25-26］。實(shí)際上，人們往往會根據(jù)研究的需要在這些培養(yǎng)基中添加不同的組分，例如胎牛血清（fetal bovine serum）、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、胰島素（insu?lin）、地塞米松（dexamethasone）、胰高血糖素（glucagon）、谷氨酰胺（l?glutamine）等。

血清的主要作用在于提供細(xì)胞生長增殖所需的激素、生長因子、轉(zhuǎn)移蛋白和其他營養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞較好的生長狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞的生長與分裂增殖［27］。然而，也有研究［26］表明在血清的長期作用下肝細(xì)胞會逐漸失去其原有的表型，有趣的是，恰恰也是利用這一點(diǎn)，無血清培養(yǎng)基被廣泛用于肝臟干細(xì)胞的研究［28］。HGF被認(rèn)為在肝再生過程中起到最重要的作用，其他細(xì)胞因子起到不同程度的輔助作用［29］。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G1期后，HGF和EGF等細(xì)胞因子通過促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，使細(xì)胞進(jìn)入S期，促進(jìn)增殖［30］。胰島素可通過作用于肝細(xì)胞表面的胰島素受體，增強(qiáng)肝細(xì)胞對葡萄糖的攝入和利用，同時(shí)促進(jìn)RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，抑制細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)肝細(xì)胞的活力與功能［31］。地塞米松、胰高血糖素為體內(nèi)重要的激素，參與細(xì)胞的糖代謝、脂類代謝等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與功能表達(dá)［32］。谷氨酰胺是人體內(nèi)含量最豐富的游離氨基酸，也是一種條件必需氨基酸［33］。作為DNA合成的前體，保持充足的谷氨酰胺有利于DNA合成，促進(jìn)細(xì)胞分裂再生。其次谷氨酰胺通過生成谷胱甘肽這一機(jī)體保護(hù)酶和其他蛋白質(zhì)巰基對抗自由基損害的抗氧化劑，減輕氧自由基造成的肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)肝組織再生［34］。

6 培養(yǎng)模型

迄今原代肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)仍主要采用傳統(tǒng)的二維貼壁培養(yǎng)模型，這一點(diǎn)和三維培養(yǎng)模型在正常原代肝細(xì)胞的研究中正如火如荼形成鮮明的對比［17，35-38］。相比于二維培養(yǎng)模型，三維培養(yǎng)模型現(xiàn)已成為公認(rèn)的能較好模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞微環(huán)境及細(xì)胞間相互作用的體外模型。目前三維培養(yǎng)模型主要包括三明治培養(yǎng)模型、聚球培養(yǎng)模型、去細(xì)胞支架培養(yǎng)模型、生物反應(yīng)器培養(yǎng)模型、微流控培養(yǎng)模型等。其中，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)模型因具有類似體內(nèi)的流體梯度及較好的可控性，是未來的研究熱點(diǎn)。本課題組在前期的研究中采用三維培養(yǎng)模型培養(yǎng)原代肝癌細(xì)胞，細(xì)胞在形態(tài)及功能上均優(yōu)于二維培養(yǎng)模型（相關(guān)結(jié)果尚未發(fā)表），這也驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)。

7 總結(jié)

目前肝癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)主要用于細(xì)胞建系/株和體外藥敏試驗(yàn)，但受限于種種客觀因素仍無法做到大范圍的推廣。主要存在的問題有：（1）人肝癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)難度遠(yuǎn)大于動(dòng)物及人正常的肝細(xì)胞，標(biāo)本來源受限，培養(yǎng)成功率低；（2）由于標(biāo)本的臨床及病理特征參差不齊，加上廣泛存在的瘤內(nèi)異質(zhì)性，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可比性及可信度均大打折扣；（3）如何保持原代肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的穩(wěn)定，這也是原代培養(yǎng)技術(shù)共同面臨的一大難題；（4）如何避免成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞的污染，使研究結(jié)果能更真實(shí)地反映肝癌細(xì)胞的特性。

總之，原代肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)方法盡管存在諸多不足，但其在肝癌細(xì)胞的體外研究中仍舊具有不可替代的重要作用。未來除了進(jìn)一步改善其分離、純化方法以及對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，還可以嘗試使用三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)模型以達(dá)到更接近體內(nèi)環(huán)境的目的。我們相信，肝癌細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善必將推動(dòng)肝癌的基礎(chǔ)及臨床研究，進(jìn)而為更多的肝癌患者帶來新的福音。

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