陳鯤 歐瑾儀 周伯春

摘? 要 為促進地方城市高校生命科學學院本科學生建立培養(yǎng)細胞、制備細胞、改造細胞以及基因/細胞治療的現代生物知識體系和技術水平，鍛煉實驗思維和提升科學素養(yǎng)，廣州大學生命科學學院開設細胞生物學理論與實驗一體化教學，從教學的主導思想、實驗內容、教學形式等方面進行一系列改革創(chuàng)新。具體以細胞原代培養(yǎng)實驗為實驗案例，探討實驗細胞生物課的課程改革情況。

關鍵詞 細胞生物學實驗;動物細胞原代培養(yǎng);實驗教學;素質教育;相差顯微鏡;實驗室

中圖分類號：G642.423? ? 文獻標識碼：B

文章編號：1671-489X（2018）18-0111-03

1 前言

細胞培養(yǎng)技術是生物學、醫(yī)學、藥學研究以及細胞治療過程中普遍應用的手段，已廣泛應用于生命科學、基因工程、細胞工程、基因/細胞治療等重要基礎研究及臨床領域，是加強學習細胞生物學理論課程知識的重要途徑[1]。為了本科學生深入認識細胞，培養(yǎng)利用細胞、改造細胞的現代細胞知識框架和技術體系，廣州大學生命科學學院開設細胞生物學實驗課程，課時為36學時，細胞原代培養(yǎng)實驗（12學時）貫穿理論和實驗教學始終。廣州大學原為廣州市屬高校，地處廣東省會廣州市，歷史悠久。隨著2015年晉升為一本院校，學院規(guī)模設備等充實擴大，研究實驗經費充足，與廣州中醫(yī)藥大學、廣東藥科大學同設大學城校區(qū)，校際交流緊密，也為進一步提升細胞生物學實驗課程教學質量提供了堅實基礎和豐富經驗。

2 以素質教育為主，著重創(chuàng)新為主導思想

課程結合翟中和主編的《細胞生物學》（第四版，高等教育出版社）與楊漢民主編的《細胞生物學實驗》（第二版，高等教育出版社），教育學生以批判接受眼光學習前輩科研成果，啟發(fā)學生科學探索的思路和方法，鼓勵學生敢于創(chuàng)新思維，打破常規(guī)，做出合理實驗假設。同時，宣講生物倫理學和善待實驗動物的態(tài)度與法規(guī)，引導學生合理運用科學技術，培養(yǎng)一批守法合規(guī)的科研工作者。

細胞培養(yǎng)技術的介紹能使學生對該技術領域有整體認識，了解儀器、方法、材料，熟悉細胞體外生長、代謝規(guī)律及影響因素[2]。細胞培養(yǎng)技術包括細胞原代培養(yǎng)和細胞傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)直接由體內取出組織或細胞進行培養(yǎng)，由于其離體時間短，性狀與體內較相似，適用于研究。傳代培養(yǎng)指把體外培養(yǎng)的原代細胞或細胞株，當細胞生長至高密度時，分殖至新的培養(yǎng)瓶中傳代，以期獲得大量同種細胞或穩(wěn)定的細胞株，延續(xù)細胞種[3]。下面以原代細胞培養(yǎng)的學生實驗為教學案例進行詳述。

實驗方法：細胞分離及原代培養(yǎng)

1）植塊培養(yǎng)法。取1～3日齡的大鼠乳鼠[4]，浸入75%乙醇約15分鐘處死，取出放在大平皿;在超凈工作臺內剪開皮膚，剖開腹腔取出需要的組織器官，置于冰冷小平皿;用PBS清洗血液，以銳剪刀修理，去除脂肪和筋膜，移到另一無菌燒杯中;剪成1 mm3小塊后，再次清洗并移入青霉素瓶中;加入胰蛋白酶1 mL，37 ℃慢速振蕩15分鐘，棄去上清液;再把組織塊接種到培養(yǎng)瓶中，共10～15塊，間距0.2～0.5 cm;輕翻轉培養(yǎng)瓶，添含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液10 mL[5];蓋好瓶塞，用封口膠封住，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);隔2～4小時后，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢轉平放，繼續(xù)培養(yǎng);隔24小時更換培養(yǎng)液，再倒置培養(yǎng)瓶，不貼壁的組織塊取出，貼壁組織繼續(xù)培養(yǎng);培養(yǎng)3～5天后可換液，補充營養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察實驗結果[6]。

2）單細胞培養(yǎng)法（酶解法）取組織的方法同上，取出后把器官放入青霉素瓶中;用PBS緩沖液清洗，剪碎，加入適量的胰蛋白酶，以蓋住細胞為宜;保持37 ℃搖勻1～2分鐘，注入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化;靜置2分鐘后，棄去上清液，注入2 mL培養(yǎng)液;用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液;吸出細胞懸液分裝至2～3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基后旋緊瓶蓋;置于倒置顯微鏡下觀察細胞數量，必要時可使用細胞計數法計數;用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶后，適當旋松瓶蓋，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)[7]。細胞培養(yǎng)2小時后開始貼附在瓶壁上，當生長細胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積75%時記為+++，占50%時記為++，占25%時記為+。

3）機械解離法以之前相同方法處死小鼠，用解剖剪剪開小鼠的腹腔，用鑷子取出小鼠的脾臟;在直徑60 mm培養(yǎng)皿中注入EZ-Sep? Mouse 1X淋巴細胞分離液4～5 mL，不銹鋼篩網蓋在培養(yǎng)皿上;用注射器活塞輕輕研磨小鼠脾臟，使得分散的單細胞透過不銹鋼篩網進入淋巴細胞分離液中;把含有脾臟細胞的分離液轉移到培養(yǎng)瓶中，加入RPMI 1640培養(yǎng)基1 mL[8]，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[9]。當生長細胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積75%時記為+++，占50%時記為++，占25%時記為+。

結果

1）植塊培養(yǎng)法實驗結果如圖1A、圖1B、圖1C所示，觀察到較多的細胞從組織塊溢出，細胞數目較多。該法是一種操作簡易、成功率高的細胞原代細胞培養(yǎng)法，大約30%的學生采用此法，成功率較高。

2）單細胞培養(yǎng)法的實驗結果如圖2A、圖2B所示，能看到較清晰的貼壁細胞，細胞分布均勻。圖2A細胞數目較多，記作+++;圖2B細胞數目較少，記作++。該法也是比較常用的原代細胞培養(yǎng)法。

3）機械培養(yǎng)法的實驗結果如圖3A、圖3B所示，能看到較清晰的懸浮的淋巴細胞，圓球形，細胞數目較多，占視野的75%，記作+++。該法常用作懸浮細胞的培養(yǎng)法。

討論? 綜上，植塊培養(yǎng)法、單細胞培養(yǎng)法、機械培養(yǎng)法都是學生實驗常用的原代細胞培養(yǎng)法。其中植塊培養(yǎng)法是成功率最高，可選材料部位多，操作最簡單的培養(yǎng)方法，翻轉培養(yǎng)瓶，以組織塊貼壁不掉落為成功。單細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)效果好，需掐準酶解時間，防止消化不足或取材不夠，消化過度、細胞失活的情況發(fā)生。第三種機械培養(yǎng)法操作較前兩種方法稍復雜，取材部位有局限，較常用作實質器官細胞培養(yǎng)。

在教學進程中，針對學生觀察乳鼠中不同部位細胞的形態(tài)結構、組織粘連性的需要，組織學生分組實驗。每組采用一種取樣方法取同一部位，多組實驗結果記錄在案，由學生完成并記錄對比數據，摸索最佳實驗效果，共享實驗成果。

3 教學管理雙管齊下，重視技能訓練

細胞培養(yǎng)實驗是細胞生物學基礎實驗，準備時間長，實驗耗材大，實驗要求高，實驗流程緊。實驗流程包括前期滅菌消毒→實驗材料乳鼠養(yǎng)殖→實驗過程取材→細胞培養(yǎng)監(jiān)控→形態(tài)學顯微觀察與記錄→實驗總結和匯報。建立周匯報制度：學生代表每周匯報并檢查進程，加強師生互動交流，促進教學進程。建立實驗室值班制度：每班一把鑰匙，交由學生組長輪流值日檢查。建立儀器使用登記制

度：學生使用大型貴重儀器（如相差顯微鏡）需登記使用日期、人員、使用情況。培養(yǎng)學生自主管理、獨立完成、愛護儀器、清潔衛(wèi)生的習慣，全面提高學生實驗素養(yǎng)和技能。

4 創(chuàng)新教學形式，激發(fā)學生興趣

開放式課堂[10]? 該課程發(fā)展日新月異，為了使學生更充分地接觸前沿知識，開闊領域思路，課堂組織形式以講授教材為主，但不局限于教材和課堂教學，理論教學以章節(jié)為單位，集文字、動畫、圖像、教學視頻于一體，有機組合教學資料[7];課后組織學生搜集細胞工程、試管嬰兒、人造器官等話題材料，制作宣傳海報等作業(yè)形式;課余邀請外院客座教授講座，滿足學生直觀感悟和理性認識。

開放式討論? 生物領域充滿未知和探索，開設每周一題、每周一例、每周一匯，引導學生針對前沿概念、諾貝爾生理學和醫(yī)學獎案例、實驗所遇問題等進行討論分析，教師認真聽取學生意見，給予參考思路或建議。

開放式實驗? 在實驗課堂中，師生角色發(fā)生改變，轉變傳統(tǒng)課堂教學以教師為中心、學生被動接受知識的局面，實驗以學生為主，教師角色從主體變?yōu)橹鲗?，從旁指導。在同學協助下，學生動手完成實驗[11]。鼓勵學生利用課余時間，充分利用校內外資源，參加創(chuàng)新大賽和“挑戰(zhàn)杯”，組隊完成開放型實驗課題，如探索有趣實驗現象，簡化原有實驗工作步驟等。

5 結語

細胞生物學是廣州大學生命科學學院本科生的基礎必修課程，其課程改革有利于培養(yǎng)創(chuàng)新型、實用型本科人才。本文以動物細胞原代培養(yǎng)實驗為例，介紹學院如何從以素質教學為主、著重創(chuàng)新培養(yǎng)的主導思想入手，輔以教學管理，注重技能培訓的教學內容革新，創(chuàng)新教學形式，激發(fā)學生興趣，全面改革細胞生物學課程。實踐證明，改革有助于提升學生的科學素養(yǎng)和實驗技能，出色地完成生物醫(yī)藥本科人才培養(yǎng)計劃。

參考文獻

[1]何建民，等.醫(yī)學七年制增設細胞培養(yǎng)課程的做法與體會[J].山西醫(yī)科大學學報：基礎醫(yī)學教育版，2006（4）：408-409.

[2]侯云霞，等.臨床醫(yī)學七年制細胞培養(yǎng)教學改革探討[J].山西醫(yī)學大學學報：基礎醫(yī)學教育版，2003（2）：139-140.

[3]翟中和，王喜忠，丁明孝.細胞生物學[D].4版.北京：高等教育出版社，2016.

[4]YANG X， WANG R， WANG X， et al. TGF-β signaling hyperactivation-induced tumorigenicity during the derivation of neural progenitors from mouse ESCs[J].Journal of Molecular Cell Biology，2018（1）：216-228.

[5]ZHONG H， CHEN K， FENG M， et al. Genipin alleviateshigh-fat diet-induced hyperlipidemia and hepatic lipidaccumulation in mice via miR-142a-5p/SREBP-1c axis[J].The FEBS Journal，2017（3）：501-507.

[6]Bayar G R， Ayd?ntu? Y S， Günhan O， et al. Ex Vivo Produced Oral Mucosa Equivalent by using the Direct Explant Cell Culture Technique[J].Balkan Medical Jour-nal，2012（3）：295-300.

[7]Banumathi E， Haribalaganesh R， Babu S S P， et al.High-yielding enzymatic method for isolation and cul-ture of microvascular endothelial cells from bovine

retinal blood vessels[J].Micro-vascular Research，2009（3）：377-381.

[8]YANG J， LI W. Comparative study on radiosensiti-vity of various tumor cells and human normal liver cells[J]. World Journal of Gastroenterology，2005（26）：4098-4101.

[9]楊漢民.細胞生物學實驗[D].2版.北京：高等教育出版社，2016.

[10]霍春月.細胞生物學網絡課程的建設與探索[J].檢驗醫(yī)學教育，2009（3）14-15.

[11]袁媧，等.導學互動式網絡教學模式在醫(yī)學細胞生物學課程中的應用研究[J].四川解剖學雜志，2010（2）：51-52，54.

[12]訾曉淵，姚玉成，熊俊，等.談研究生細胞生物學課程的改革[J].醫(yī)學教育，2001（4）：13-14.