淀粉脫支酶的制備和應(yīng)用

根據(jù)對底物作用方式的不同，淀粉脫支酶主要分為普魯蘭酶和異淀粉酶。它們可以專一、高效地水解支鏈淀粉中的分支鍵，在工業(yè)中的應(yīng)用非常廣泛。在淀粉酶解過程中添加普魯蘭酶或異淀粉酶可以加快淀粉酶解反應(yīng)的速度，縮短酶解時間，提高產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率，降低其它酶制劑的使用量。目前，普魯蘭酶和異淀粉酶已經(jīng)被廣泛用于葡萄糖、麥芽糖、果糖、低聚糖、麥芽糊精等產(chǎn)品的生產(chǎn)。

研究者嘗試采用重組技術(shù)來提高淀粉脫支酶的產(chǎn)量和性能。中國專利CN201610306855.6提供一種性能改善的普魯蘭酶嵌合體及高產(chǎn)該嵌合體的巴斯德畢赤酵母突變株，其對來源于Bacillus deramificans和Bacillus naganoensis的普魯蘭酶編碼基因進行密碼子優(yōu)化，利用DNA Shuffling進行分子改組，得到一種嵌合體基因，嵌合體酶在酸性條件下能保持較高酶活，同時比酶活高于來源于Bacillus deramificans的普魯蘭酶。編碼嵌合體的基因WXP03在巴斯德畢赤酵母細胞內(nèi)表達出普魯蘭酶酶活，重組酶最適作用溫度55℃，最適pH 4.5酶活半衰期約18小時，在55℃，pH 4.0酶活半衰期約為12小時。進一步誘變篩選獲得一株搖瓶發(fā)酵酶活水平明顯提高的巴斯德畢赤酵母突變株。突變株在5 L發(fā)酵罐上的發(fā)酵酶活達1 800 U/mL。CN201110459137.X涉及一種酸性耐熱異淀粉酶基因工程菌及其應(yīng)用。其采用化學合成獲得異淀粉酶Tfu_1891編碼基因序列，以pT7-7為表達載體，以E.coli BL21(DE3)為表達宿主，在工業(yè)級發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過誘導(dǎo)重組異淀粉酶發(fā)酵活力達到3 185 U/mL。該重組酶具有淀粉α-1，6葡萄糖苷鍵水解活性，最適溫度為40～50℃，最適pH 5.5，在50℃下保溫30 h，酶活仍保留50%以上。重組酶具有淀粉脫支活性，能水解淀粉中支鏈淀粉形成直鏈淀粉，該酶與α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)配使用可以顯著提高環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率，適合環(huán)糊精的工業(yè)生產(chǎn)。CN201610043739.X公開了一種普魯蘭酶突變體PulB-d99-D436H的制備方法及其應(yīng)用，其獲得方法是截取長野芽孢桿菌(Bacillus naganoensis)普魯蘭酶的100-926氨基酸肽段，同時將其436位點的天冬氨酸Asp突變?yōu)榻M氨酸His，改造得到一個新的普魯蘭酶突變體。該突變體基因以同源重組的方式整合到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)染色體中構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌，能穩(wěn)定地發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭酶。該突變體酶能夠提高淀粉和普魯蘭糖的水解效率。CN201210008693.X公開了一種來源于蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)菌普魯蘭酶基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1，該酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:2，該普魯蘭酶能水解淀粉中的α-1，6-糖苷鍵，不水解α-1，4-糖苷鍵，是一種I型普魯蘭酶，利用該基因生產(chǎn)的重組普魯蘭酶可以應(yīng)用于淀粉加工中水解淀粉或者糊精中的α-1，6-糖苷鍵以提高淀粉的利用率。CN201610368731.0公開了一種異淀粉酶及其基因、含有該基因的工程菌及其應(yīng)用。提供了淀粉水解酶系中關(guān)鍵酶之一的異淀粉酶基因，來源為corallococcus sp，該基因全長為2 436 bp，G+C含量為66%，編碼811個氨基酸。利用該基因構(gòu)建的工程菌株能高效表達異淀粉酶，該酶以土豆淀粉為測活底物，通過碘液檢測異淀粉酶的活性，其比活力高達70 600 U/mg。CN201510281727.6涉及一種來源于sulfolobus tokodaii的耐高溫異淀粉酶基因，將其克隆、表達在E.coli Rosetta中，該異淀粉酶耐高溫、酶活力穩(wěn)定，具有很強工業(yè)應(yīng)用潛力；用于糖燃料電池時，可使淀粉類物質(zhì)徹底水解為葡萄糖，從而提高能量轉(zhuǎn)化效率，拓展生物燃料電池的應(yīng)用范圍。CN201210141970.4公開了一種生產(chǎn)重組混合異淀粉酶的方法。首先分別克隆解淀粉假單胞桿菌和軟腐細菌的異淀粉酶基因；構(gòu)建含解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達框架和軟腐細菌的異淀粉酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體，并將其表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，篩選高表達以上所述的兩種異淀粉酶的重組子作為工程菌；發(fā)酵畢赤酵母工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶。該發(fā)明生產(chǎn)的重組混合異淀粉酶出現(xiàn)酶反應(yīng)的兩個最適溫度和pH，理化特性高，適合于多種用途；由于實現(xiàn)兩個酶基因同時在其畢赤酵母中表達，使其異淀粉酶產(chǎn)量顯著提高，起到降低生產(chǎn)成本的作用。

隨著新型淀粉加工產(chǎn)品及工藝的不斷涌現(xiàn)，現(xiàn)代淀粉加工工業(yè)對淀粉脫支酶的性能要求不斷提高。開發(fā)高催化活性、高特異性、高產(chǎn)率的系列淀粉脫支酶將成為淀粉脫支酶研究的新趨勢。