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(1.青島大學生物醫(yī)用材料與工程研究院，青島大學化學化工學院, 青島 266071；2.纖維新材料與現代紡織國家重點實驗室培育基地，青島大學材料科學與工程學院，青島 266071)

毛細管電泳技術發(fā)展于20世紀80年代，由于其具有操作簡單、樣品和緩沖液用量少、分離快速高效、有多種分離模式等優(yōu)點，很快成為一種常用的分離手段?？梢杂糜诜治鰺o機離子、小分子、氨基酸、多肽和蛋白質，甚至是單細胞水平的分析，廣泛應用于藥物[1-3]、生命科學[4]、環(huán)境[5]等領域。在過去的幾十年中，科學家不斷的對毛細管電泳技術進行研究，促使毛細管電泳技術得到快速發(fā)展?，F如今，毛細管電泳技術已經成為分析多肽最有吸引力的工具之一[6]。

1 毛細管電泳

毛細管電泳(Capillary Electrophoresis)又高效毛細管電泳(HPCE)，是指以高壓電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據樣品中各個組分在毛細管中分配行為和淌度的差異而進行高效、快速分離的一種新型的液相分離分析。

為滿足對不同類型多肽分析的需求，科學家研發(fā)出多種毛細管電泳分離模式，推動的毛細管電泳技術的不斷發(fā)展和完善。毛細管電泳技術主要有：毛細管凝膠電泳、毛細管區(qū)帶電泳、毛細管膠束電動色譜、毛細管等速電泳、毛細管電色譜、親和毛細管電泳、非水毛細管電泳、毛細管陣列電泳、芯片毛細管電泳等。有些毛細管電泳還可以與其他分析方法聯用，例如；毛細管電泳-二極管陣列[7]、毛細管電泳-液相色譜、毛細管電泳-質譜、毛細管電泳-化學發(fā)光等[8]。

2 毛細管電泳在多肽分析中的應用

2.1 多肽的分離

隨著分析技術的不斷發(fā)展和完善，涌現出很多分離分析手段。毛細管電泳技術發(fā)展較為迅速，應用領域廣泛，常用于多肽分離。薛洪寶等[9]利用毛細管電泳建立了一種簡單、快捷、高效的分析方法，并利用此法分離了15種氨基酸和2種多肽，獲得了令人滿意的實驗結果。程燕等[10]通過毛細管電泳技術分離了16種二肽，并研究了緩沖液濃度及PH值對二肽衍生物分離的影響。在最優(yōu)的實驗條件下，實現了14 min內成功分離16種CEOC二肽衍生物。

2.2 多肽的純度鑒定

對于測定多肽的純度常用的方法是HPLC法，此方法可能存在分析時間長，分離效果不佳，成本昂貴等局限，因此很有必要開發(fā)其他方法對多肽純度鑒定。宮菲菲等[11]利用毛細管區(qū)帶電泳(CZE)方法測定艾塞那肽純度，并初步考查其穩(wěn)定性。其純度測定結果與高效液相色譜法基本一致，但此法的分離效果更好，分析時間短。Kang等[12]用聚二甲基丙烯酸酰胺動態(tài)涂層修飾毛細管，結合PF和短端進樣等技術快速測定了葉酸對應體的純度。

2.3 多肽的性質研究

毛細管電泳對多肽性質的研究主要集中在分子量測定、穩(wěn)定性研究以及多肽的結構分析。

劉靜等[13]采用毛細管電泳發(fā)測定了水解后大豆多肽的分子量，結果表明，所制樣品分子量主要分布在8200Da以下。廖海明等[14]以葡萄糖為分離介質，測定了15種蛋白質分子量，其測定結果與平板SDS-聚丙烯酰胺膠電泳(SDS-PAGE)測定的結果基本一致。

測定多肽組分的方法主要有：高效液相色譜法、質譜、電泳和核磁共振等。最常用的是反相高效液相色譜法，但是此法卻存在一定的弊端：對相對分子質量較小的多肽分離效果不太理想。毛細管電泳技術具有其他分析方法不具備的優(yōu)勢，例如分析周期短、分離方式多樣等。王辰等[15]利用高效毛細管電泳法研究了腦蛋白水解產物中的多肽組分，并測定了進口腦蛋白水解產物注射液的多肽組分分布。以溶菌酶(相對分子質量為14400)和胰島素(相對分子質量為6000)為標記物，兩者間的峰為多肽，進口腦活素注射液中所含組分多數集中在>14400區(qū)域，“強腦素”所含多肽的相對分子質量大部分集中在6000～14400之間。

利用HPCE分離分析多肽，可以得到多肽的結構信息。李峰等[16]通過高效毛細管法得到了蜈蚣藥材的“指紋圖譜”，鑒別了蜈蚣藥材商品的種類，對其質量進行控制。

3 毛細管電泳與其他技術聯用分析多肽

隨著當今科技的快速發(fā)展，多種分析技術聯用的優(yōu)點已逐漸被人們意識到，比如高效液相色譜-質譜法聯用技術[17]。隨后，基于毛細管電泳技術與其他聯用技術聯用的技術相繼被開發(fā)出來。人們對于毛細管電泳技術的研究日益深入，涌現出一些其他可使用的檢測器，例如激光誘導熒光檢測器，二極管陣列檢測器等。但是這些檢測器或多或少存在一些不足。例如在利用毛細管電泳分析多肽類藥物時，由于多肽類藥物雜質的結構與多肽的結構非常相近，如果采用單一的分析方法，很難得到滿意的結果。因此，采取兩種及兩種以上分析原理成為發(fā)展趨勢。近些年國內外者研究了毛細管電泳技術與其他技術聯用分析多肽，并且得到了令人滿意的結果[18，19]。

3.1 毛細管電泳-質譜

高分離效率的毛細管電泳與具有優(yōu)越結構定性能力的質譜結合，形成CE-MS聯用技術，此技術已經可以與HPLC-MS技術媲美。特別是近幾年質譜技術的快速發(fā)展，尤其是靈敏度的提高，很大程度上改善了由于CE進樣量小導致檢測靈敏度較低的缺點。但CE-MS聯用技術在實際的運用中依然存在很大的挑戰(zhàn)，把CE與MS聯用要比把HPLC與MS聯用困難得多。因為CE一端插入緩沖液中，而另一端要跟質譜相連。CE的工作必須有閉合回路，形成高壓電場。這就要求CE和MS之間不僅要有良好的接觸，更要有高效的離子化效率。而HPLC與MS可以通過分流技術，使流出色譜柱的流動相直接與質譜儀相連，離子化之后檢測，二者之間不需要電的接觸[20]。

CE-MS聯用技術能對多肽雜質進行結構鑒定，是表征多肽雜質的一種非常重要的分析手段。Hoitink等[21]利用CE-MS法分析了戈舍瑞林在堿性條件(pH=9)、酸性條件(pH=5)下降解產物的結構，為多肽雜質的研究提供了參考。Taichrib等[22]用CZE-ESI-Q-TOF-MS聯用技術研究了替可克肽及其雜質，分析了41個相關肽的結構，同時還做了CE-MS與LC-MS的對比，結果發(fā)現CE-MS對缺失肽有較好的分離效果。Yu等[23]利用HPLC/ESI-MS/MS技術測定了單細胞中的谷光甘肽。Cha等[24]采用毛細管柱-電噴霧質譜成功鑒定了宮頸癌中的237個肽段和163個蛋白質。Rittgen等[25]用CE-MS分析了Amanita菌毒性多肽。CE-MS聯用的關鍵因素是接口技術，有離線聯用和在線聯用兩種模式。CE-MS在線聯用具有更智能且樣品損耗少的優(yōu)點，被廣泛研究。Nguyen等[26]開發(fā)了一種新型的CE-MS技術，該技術采用無鞘液接口，他們證實此技術可有效的用于復雜混合多肽的分析。

CE-MS聯用技術用于多肽研究的發(fā)展趨勢，主要取決于CE分析能力的提高以及更高效更靈敏新型接口的開發(fā)。發(fā)展毛細管涂層技術，減少毛細管壁對多肽的非特異性吸附可以有效的提高CE的分析能力；另一方面要開發(fā)各種模式的接口，以滿足CE-MS技術的發(fā)展需求，當今常用的接口技術主要是自對準負壓混合液的電噴霧接口和無保套的金屬魯棒性和高靈敏度的樣品定量涂布發(fā)射器接口[27]，這些接口技術遠遠不能滿足CE-MS聯用技術的發(fā)展需求，這也是現階段限制CE-MS聯用技術發(fā)展的因素。因此，開發(fā)更多接口技術對CE-MS聯用技術的發(fā)展有重大的意義。

3.2 毛細管電泳-色譜

毛細管凝膠電泳是基于分子篩原理進行多肽的分離。但是此方法在分離多肽時存在一些不足，例如一次性處理樣品的量少，并且不能進行大量的樣品收集制備。為了克服這些不足，Dominguez等[28]等將毛細管電泳技術與HPLC技術聯用，用于測試capillary-HPLC列和優(yōu)化分離條件，此方法提高了大豆多肽的分離效率，為快速分離純化不同大豆食品中的多肽提供了方法。葉淋泉等[29]探索了液滴接口二維分離技術，他們以液滴作為接口連接高效液相色譜與毛細管電泳，分析了蛋白質降解的多肽混合物，獲得了大于3000的峰容量，豐富了毛細管電泳-色譜聯用技術形式，擴展了此技術的應用領域。

3.3 毛細管電泳-化學發(fā)光

化學發(fā)光法是公認比較靈敏的檢測技術[30]。它是根據被測物質在特定條件下化學發(fā)光強度的不同來定量分析的技術。相比于其他光學檢測方法，化學發(fā)光法不受來自光源雜散光的干擾，很容易獲得較低的檢測噪聲。將高分離效率的毛細管電泳技術與高靈敏度的化學發(fā)光法聯用形成毛細管電泳-化學發(fā)光法(CE-CL)。CE-CL具有背景信號地，檢測靈敏；有較寬的線性范圍簡單，可實現定性分析，廣泛應用于多肽、氨基酸及藥物等領域[31]。CE-CL技術的關鍵在于CL試劑的引入和檢測界面的構建。CE-CL常用的接口檢測模式是柱檢測模式[32，33]。

蘇孫煌[34]研制了“毛細管電泳-電致化學發(fā)光檢測器”，該檢測器采用的分離檢測對象為Luminol-NaOH，通過實驗證明該檢測器檢測具有較高的靈敏度及較好的重現性，可實現對多肽的快速分離與檢測。Zhou等[35]通過CE-CL聯用技術，氧化石墨烯作為載體，檢測了病人血清中的癌胚抗原，檢出限為4.8 pgmL-1。此方法解決了在測試過程中對樣品信號的干擾問題，很大程度上提高了檢測靈敏度和精度。Zhao等[36]利用MCE-CL方法檢測了紅細胞內谷胱甘肽的含量,其檢出限為5×10-20mol。此方法比激光誘導熒光法檢測紅細胞內谷胱甘肽含量的方法操作更加簡單，靈敏度提高顯著。毛細管電泳存在蛋白質特異性吸附問題，Liu等[37]開發(fā)了一種動態(tài)涂層的CE-CL檢測系統(tǒng)，解決了蛋白質特異性吸附的問題。聚吡咯烷酮粘度低易溶于水，很容易進入毛細管并覆于毛細管的內壁。實驗結果顯示，采用聚吡咯烷酮以后，蛋白質特異性吸附現象明顯減弱，且此方法具有較好的重復性。

CE-CL聯用技術兼具高靈敏度和高分離效率的特點，已成為一種高效的分離檢測多肽的方法。然而CE-CL聯用技術在多肽的分離檢測方面重現性不太穩(wěn)定，因為此技術不僅對毛細管電泳技術有較高的要求，它還受到化學發(fā)光反應物流速、反應物混合模式以及反應類型的影響。CE-CL聯用技術線性范圍大約只有兩個數量級[38]，目前CL標記技術也不成熟，這就限制了CE-CL聯用技術的發(fā)展。在未來幾年，CE-CL聯用技術在多肽分析方面的應用還需在以下方面深入研究：(1)開發(fā)新型CE-CL聯用儀器接口，提高系統(tǒng)的選擇性、穩(wěn)定性和靈敏度；(2)CE-CL聯用技術可以和色譜、質譜等方法聯用，以獲得更好的性能；(3)擴展CE-CL聯用技術的檢測范圍。

3.4 毛細管電泳-激光誘導熒光檢測法

激光誘導熒光檢測器(LIF)運用于毛細管電泳技術，對毛細管電泳技術的發(fā)展具有里程碑意義。激光誘導熒光檢測器的引用，打破了毛細管電泳檢測靈敏度不高的限制，使檢測分析靈敏度提升了3～4個數量級[39]，一般情況下LIF的檢出限比普通的UV法低很多，并且在一定條件下還可以實現單個細胞的檢測。因此，CE-LIF聯用技術在生物分析中具有很大的應用前景[40]。王宇飛等[41]用毛細管電泳-激光誘導熒光直接檢測氧化型和還原型谷胱甘肽及其構成氨基酸。在此之前檢測谷胱甘肽的方法有很多，但是能夠同時檢測其構成氨基酸的方法較少。他們的方法能夠快速的實現基線分離，并且具有檢測線低的優(yōu)勢。唐敏等[42]利用激光誘導熒光檢測微流控芯片毛細管電泳技術分離了牛血清蛋白的胰蛋白酶酶解產物，并分析了多種影響電泳分離性能的因素，如緩沖液組成、表面活性劑濃度等，確定了最優(yōu)實驗條件，取得了良好的實驗結果。

4 結語

毛細管電泳技術用于多肽研究的發(fā)展方向仍然是提高多肽分析的分辨率和速率。為了滿足生命科學研究日新月異發(fā)展的要求，應將毛細管電泳技術與其他分析技術更好地結合，繼承各自的優(yōu)點，摒棄各自的缺點，可以實現更快速、更準確的分析多肽，同時也能拓寬毛細管電泳的應用領域。

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