李　明，任麗麗，王　雪

紫蘇葉為一年生、直立草本唇形科植物紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的葉［1］.《中國藥典》記載，紫蘇葉味辛、性溫、歸肺、脾經(jīng)，具有解表散寒、行氣和胃的功能，用于風(fēng)寒感冒、咳嗽嘔吐、妊娠嘔吐、魚蟹中毒［2］.現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紫蘇葉具有抗過敏、抗炎、抗腫瘤、降血脂、抗菌、抗氧化、抗皮膚衰老等多種功能［3-5］.此外，紫蘇葉營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高達(dá)25%，含多種人體所需微量元素及16種人體所需氨基酸，其中包含7種人體必需氨基酸，微量元素中鈣和磷含量較高［4］.以紫蘇葉為原料提取功能性成分一直受到研究者的關(guān)注［6］.從紫蘇葉中提取揮發(fā)油［7］、迷迭香酸［8］、功能性多糖［9，10］、黃酮類化合物［11，12］、花色苷［13］等相關(guān)研究已有報(bào)道.紫蘇葉是傳統(tǒng)的藥食兩用植物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，目前，市場(chǎng)上以紫蘇葉為主要原料的食品很少，但紫蘇葉食品的研究卻一直受到研究者的關(guān)注.紫蘇油［14］、紫蘇乳飲料［15］、紫蘇復(fù)合飲料［16-18］、紫蘇保健食品［19-22］、紫蘇醋［23］、紫蘇果酒［24］、紫蘇醬［25］等食品已有研究.本研究以紫蘇葉為主要原料，采用生物發(fā)酵法制作紫蘇葉發(fā)酵飲料及紫蘇葉蒸餾酒，并對(duì)其風(fēng)味成分進(jìn)行了初步檢測(cè)，以期豐富紫蘇食品種類，促進(jìn)紫蘇資源的開發(fā)與利用，提高紫蘇的產(chǎn)業(yè)價(jià)值.

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1主要材料

紫蘇葉（采自內(nèi)蒙古呼和浩特市賽罕區(qū)金河鎮(zhèn)七圪臺(tái)村現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生態(tài)園）、酵母（富門伯恩，瑞典）、白砂糖（市售）.1.1.2主要試劑

鹽酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸酮、氯化鈉、葡萄糖等均為分析純.

1.2　主要儀器與設(shè)備

FA2004型電子天平：上海市安亭電子儀器廠；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；SLI-700型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海安亭科學(xué)儀器廠；ISQ氣相色譜-質(zhì)譜儀：ThermoFisher中國有限公司.

1.3　方法

1.3.1工藝流程

工藝流程見圖1.

圖1　工藝流程

1.3.2單因素實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中以發(fā)酵結(jié)束后的酒精含量、殘?zhí)呛亢透泄僭u(píng)分為指標(biāo)，分別考察了酵母接種量、發(fā)酵溫度、白砂糖用量、料液比四個(gè)因素對(duì)紫蘇發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響.

（1）酵母接種量對(duì)紫蘇葉發(fā)酵過程及風(fēng)味的影響.固定料液比為1∶16，白砂糖添加量為20%，發(fā)酵溫度為20℃，發(fā)酵時(shí)間為15d，當(dāng)酵母添加量分別為0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰時(shí)，考察酵母添加量對(duì)紫蘇葉發(fā)酵過程及風(fēng)味的影響.

（2）發(fā)酵溫度對(duì)紫蘇葉發(fā)酵過程及風(fēng)味的影響.固定料液比為1∶16，白砂糖添加量為20%，發(fā)酵時(shí)間為15d，酵母添加量為1.5‰，當(dāng)發(fā)酵溫度分別為16℃，20℃，24℃，28℃，32℃和36℃時(shí)，考察溫度對(duì)紫蘇葉發(fā)酵過程及風(fēng)味的影響.

（3）白砂糖用量對(duì)紫蘇發(fā)酵飲料及風(fēng)味的影響.固定料液比為1∶16，發(fā)酵溫度為20℃，酵母添加量為1.5‰，發(fā)酵時(shí)間為15d，白砂糖添加量分別為10%、15%、20%、25%，30%時(shí)，考察不同的白砂糖用量對(duì)紫蘇葉發(fā)酵過程及風(fēng)味的影響.

（4）料液比對(duì)紫蘇發(fā)酵飲料及風(fēng)味的影響.固定酵母添加量為1.5‰，發(fā)酵溫度為20℃，發(fā)酵時(shí)間為15d，白砂糖添加量為20%，料液比分別為1∶4、1∶8、1∶16、1∶32，1∶64時(shí)，考察不同的料液比對(duì)紫蘇葉發(fā)酵過程及風(fēng)味的影響.1.3.3正交實(shí)驗(yàn)

通過上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，以感官評(píng)分為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)工藝條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表1

表1　發(fā)酵條件優(yōu)化設(shè)計(jì)表

1.3.4測(cè)定方法與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

（1）酒度測(cè)定.酒度的檢測(cè)依據(jù)GB/T 15038-2006葡萄酒、果酒通用試驗(yàn)方法.

（2）殘?zhí)呛繙y(cè)定.殘?zhí)呛繙y(cè)定依據(jù)GB/T 5009.7-2008食品中還原糖的測(cè)定方法.

（3）香氣成分測(cè)定.蒸餾酒樣品用煮沸冷卻后的超純水稀釋至10%vol，吸取8mL置于20mL頂空瓶中，加氯化鈉至飽和，進(jìn)行HS-SPMEGC-MS分析.紫蘇發(fā)酵飲料取樣后直接進(jìn)行HS-SPME-GC-MS分析.

HS-SPME條件：采用DVB/CAR/PDMS的三相萃取頭，樣品在50℃下預(yù)熱5min，萃取吸附45min后直接進(jìn)樣，250℃下GC解析5min.利用GC-MS對(duì)樣品進(jìn)行分析.

氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）分析法的色譜分析條件：

GC條件：SE-54型石英毛細(xì)管柱（0.25mm*30m），進(jìn)樣溫度250℃，采用程序升溫，32℃保持3min，2℃/min升溫至50℃，保持2min，再以4℃/min升溫至230℃，保持8min，進(jìn)樣口溫度為250℃.用高純氦氣作載氣，流速1mL/min.

MS條件：EI電離源，離子源溫度230℃，電子能量70eV，掃描范圍35.0～350.0amu.

（4）感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn).由10人組成的品評(píng)小組，根據(jù)表2紫蘇發(fā)酵飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)進(jìn)行打分.

表2　紫蘇發(fā)酵飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2　結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)過程中，通過測(cè)定殘?zhí)呛亢途凭?，考察紫蘇葉在不同發(fā)酵條件下的發(fā)酵特點(diǎn).同時(shí)，由于發(fā)酵過程中，紫蘇葉發(fā)酵汁的風(fēng)味決定了發(fā)酵飲料的風(fēng)味及蒸餾酒的香氣，因此，研究中以感官評(píng)定作為輔助手段，考察不同發(fā)酵條件下紫蘇葉發(fā)酵汁的風(fēng)味，以確定紫蘇葉發(fā)酵飲料的最佳制作條件.

2.1　酵母添加量對(duì)發(fā)酵及風(fēng)味的影響

由圖2可知，隨著酵母添加量的增加，當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后，各樣品殘?zhí)呛侩S酵母添加量的增加而不斷下降.這是因?yàn)楫?dāng)酵母添加量不斷增加時(shí)，酵母在生長繁殖時(shí)所消耗的白砂糖的量也在不斷增加.當(dāng)酵母添加量在0.5‰～1.5‰時(shí)，隨著酵母添加量的增加，酒精含量隨之上升.當(dāng)酵母添加量超過1.5‰時(shí)，酒精含量反而開始下降.

圖2　酵母添加量對(duì)發(fā)酵的影響

由圖3可知，當(dāng)酵母添加量在0.5‰～1.5‰范圍時(shí)，發(fā)酵汁的感官評(píng)分不斷上升.當(dāng)酵母添加量超過1.5‰時(shí)，發(fā)酵汁的感官評(píng)分開始下降，這主要是因?yàn)楫?dāng)酵母添加量在0.5‰～1.5‰范圍時(shí)，隨著酵母添加量的增加，發(fā)酵過程中的酒精含量及風(fēng)味物質(zhì)的含量不斷上升，使發(fā)酵汁的感官評(píng)分不斷上升.但當(dāng)酵母添加量過高時(shí)，導(dǎo)致發(fā)酵汁中出現(xiàn)令人不悅的酵母味，從而使感官評(píng)分下降.

圖3　酵母添加量對(duì)風(fēng)味的影響

2.2　發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵及風(fēng)味的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，殘?zhí)呛坎粩嘞陆?，這主要是因?yàn)?，隨著初始發(fā)酵溫度的提高，酵母細(xì)胞中的各種生化反應(yīng)速度加快，酵母代謝活動(dòng)旺盛，糖分被大量消耗，導(dǎo)致殘?zhí)呛坎粩嘞陆?

圖4　發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵的影響

當(dāng)發(fā)酵溫度由16℃升至20℃時(shí)，酒精含量隨發(fā)酵溫度的上升而增加，達(dá)到20℃時(shí)酒精含量最高，當(dāng)發(fā)酵溫度超過20℃時(shí)，酒精含量隨發(fā)酵溫度的上升反而開始下降.這主要是因?yàn)?，?dāng)發(fā)酵溫度在16℃時(shí)，由于發(fā)酵溫度低，酵母生長和繁殖速度慢，導(dǎo)致殘?zhí)呛枯^高，酒精含量低.當(dāng)發(fā)酵溫度高于20℃時(shí)，酵母細(xì)胞中的各種生化反應(yīng)速度不斷加快，酵母代謝旺盛，在發(fā)酵初期糖分消耗過快，導(dǎo)致殘?zhí)呛肯陆档耐瑫r(shí)，酒精含量也不斷降低.

由圖5可知，發(fā)酵汁的感官評(píng)分隨發(fā)酵溫度的提高先升后降，當(dāng)發(fā)酵溫度為20℃時(shí)，感官評(píng)分最高.這可能是因?yàn)?，?dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)（16℃），發(fā)酵緩慢，鮮紫蘇葉原有的味道過重，令人產(chǎn)生不適.當(dāng)發(fā)酵溫度較高時(shí)（＞20℃），酵母代謝過快，呈香物質(zhì)沒有充分形成，甚至由于發(fā)酵過快出現(xiàn)微苦的滋味，導(dǎo)致感官評(píng)分不斷下降.在發(fā)酵溫度為20℃，發(fā)酵汁中不僅具有紫蘇葉特有香氣，而且香氣更加柔和、悅?cè)?，感官評(píng)分最高.

圖5　發(fā)酵溫度對(duì)風(fēng)味的影響

2.3　白砂糖添加量對(duì)發(fā)酵及風(fēng)味的影響

由圖6可知，隨著白砂糖添加量的不斷增加，殘?zhí)呛坎粩嗌仙?但酒精含量隨白砂糖添加量的增加先升后降.這可能是因?yàn)?，?dāng)白砂糖的添加量達(dá)到25%～30%范圍時(shí)，白砂糖濃度較大，發(fā)酵液滲透壓較高，抑制了酵母的活性，導(dǎo)致酒精含量下降，殘?zhí)呛恳诧@著上升.

圖6　白砂糖用量對(duì)發(fā)酵的影響

由圖7可知，發(fā)酵汁的感官評(píng)分隨白砂糖添加量的增加先升后降.這主要是因?yàn)楫?dāng)白砂糖添加量在5%～20%范圍內(nèi)時(shí)，隨白砂糖添加量的增加，酵母發(fā)酵環(huán)境更加適合，風(fēng)味成分更加豐富，達(dá)到20%時(shí)，感官評(píng)分最高.當(dāng)白砂糖添加量達(dá)到25%～30%范圍時(shí)，由于酵母活性受到抑制，香氣成分沒有充分形成，同時(shí)發(fā)酵汁的殘?zhí)呛枯^高，口感不適，導(dǎo)致感官評(píng)分下降.

圖7　白砂糖用量對(duì)風(fēng)味的影響

2.4　料液比對(duì)發(fā)酵及風(fēng)味的影響

由圖8可知，當(dāng)料液比在1∶4～1∶16的范圍內(nèi)變化時(shí)，殘?zhí)呛坎粩嘞陆?，酒精含量不斷上?當(dāng)料液比在1∶16～1∶64的范圍內(nèi)變化時(shí)，殘?zhí)呛亢途凭坎辉侔l(fā)生明顯的變化.這可能是因?yàn)樽咸K葉本身具有一定的抑菌作用，當(dāng)料液比在1∶4和1∶8時(shí)，紫蘇葉所占比重較大，汁液較濃，抑制了酵母的活性，導(dǎo)致殘?zhí)呛枯^高，酒精含量較低的結(jié)果.當(dāng)料液比在1∶16～1∶64時(shí)，紫蘇葉所占比重小，紫蘇葉浸出物對(duì)酵母的抑制作用顯著降低，使酵母能夠正常生長和繁殖，在酵母和白砂糖添加量固定的前提下，殘?zhí)呛亢途凭康淖兓伙@著.

圖8　料液比對(duì)發(fā)酵的影響

由圖9可知，料液比在1∶4～1∶64的范圍內(nèi)，感官評(píng)分先升后降，在料液比為1∶16時(shí)達(dá)到最高.這主要是因?yàn)椋?dāng)料液比為1∶4和1∶8時(shí)，紫蘇葉含量較高，紫蘇特有的風(fēng)味過重，令人不適.當(dāng)料液比為1∶32和1∶64時(shí)，紫蘇葉比重過低，紫蘇特有的風(fēng)味不突出，導(dǎo)致感官評(píng)分下降.

圖9　料液比對(duì)風(fēng)味的影響

2.5　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)酵母添加量、發(fā)酵溫度、白砂糖添加量和料液比四個(gè)因素按照L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3.

表3　發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3極差R大小，可知影響發(fā)酵因素的主次順序?yàn)椋篊（白砂糖添加量）＞D（料液比）＞B（發(fā)酵溫度）＞A（酵母添加量），采用直觀分析法，可得最優(yōu)工藝條件組合為：C2D2B2A2，即初始白砂糖添加量為20%、料液比為1∶16、發(fā)酵溫度為20℃、酵母添加量為1.5‰.在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，所得產(chǎn)品感官評(píng)分的平均值為91分，表明C2D2B2A2為最優(yōu)組合.

2.6　紫蘇葉發(fā)酵飲料及蒸餾酒香氣成分分析

紫蘇發(fā)酵飲料及蒸餾酒的主要香氣成分的氣質(zhì)色譜總離子流圖見圖10，各組分鑒定的結(jié)果見表4.

表4　紫蘇葉發(fā)酵飲料及蒸餾酒香氣成分鑒定結(jié)果

由表4可知，采用GC-MS技術(shù)在紫蘇葉發(fā)酵飲料樣品中共鑒定出24種香氣成分，這些成分主要是酯類10種、醇類2種、酸類4種、其他類8種，分別占41.67%、8.33%、16.67%、37.5%.在紫蘇葉酒樣中共鑒定出9種香氣成分，這些成分主要是醇類2種、酯類3種、酮類2種、其它類2種，分別占22.22%、33.33%、22.22%、22.22%.

圖10　紫蘇葉發(fā)酵飲料（a）及蒸餾酒（b）香氣成分的GC-MS總離子色譜圖

由香氣成分的分析結(jié)果可知，在兩種樣品的香氣成分中，酯類物質(zhì)所占比重都是最高，其中辛酸乙酯含量最多，在發(fā)酵飲料及蒸餾酒中的比重分別為17.54%和7.38%.有研究表明，發(fā)酵酒香氣的主體香氣物質(zhì)為四大酯類（乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯與乙酸乙酯）與兩大醇類（異戊醇與異丁醇）［26］.結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步得出，辛酸乙酯對(duì)紫蘇葉發(fā)酵飲料及蒸餾的香氣貢獻(xiàn)較大，并與其他酯類、醇類、酸類等化合物共同作用形成了紫蘇發(fā)酵產(chǎn)品的獨(dú)特香氣.另外，通過與發(fā)酵飲料香氣成分的結(jié)果對(duì)比可知，蒸餾酒的香氣成分在種類、數(shù)量及含量上都發(fā)生了變化，尤其是在香氣成分的數(shù)量上遠(yuǎn)少于發(fā)酵飲料.原因可能有兩個(gè)方面：一是在蒸餾酒制備過程中，加熱處理使發(fā)酵液的溫度逐漸上升，在溫度不斷變化的過程中及高溫蒸餾期間，發(fā)酵液中發(fā)生的復(fù)雜生化反應(yīng)使香氣成分發(fā)生了改變；二是在蒸餾過程中香氣成分可能出現(xiàn)損失.在蒸餾前后，香氣成分的改變機(jī)制還有待于進(jìn)一步的深入研究.

3　結(jié)論

對(duì)紫蘇葉發(fā)酵飲料及其蒸餾酒制作條件的優(yōu)化結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為：料液比為1∶16、發(fā)酵溫度為20℃、初始白砂糖添加量為20%、酵母添加量為1.5‰.此條件下制作的紫蘇葉發(fā)酵飲料感官品質(zhì)、發(fā)酵效果最佳，口感純正、適宜飲用，所得蒸餾酒具有紫蘇葉特有的香氣.采用頂空固相微萃?。℉S-SPME），通過GC-MS分析紫蘇葉發(fā)酵飲料的香氣成分，初步鑒定出24種化合物；紫蘇葉蒸餾酒的香氣成分初步鑒定出9種化合物.

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