邵苗苗，許 諾，劉鐘西，柳清華，王 棟，胡書海，李曉杰

(1.大連醫(yī)科大學 口腔醫(yī)學院，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學中山學院，遼寧 大連 116000)

LncRNAs可定義為長度>200 nt，無蛋白質編碼能力的轉錄物[1]。LncRNAs在干細胞生物學，發(fā)育，分化等多種生物學過程中發(fā)揮重要作用，幾乎與基因表達的所有步驟都有關聯(lián)，包括基因轉錄，前mRNA剪接，RNA衰變和翻譯。這些程序中的任何一環(huán)出現(xiàn)問題都會導致多種疾病的發(fā)生。體內外的研究已證實，lncRNAs的表達與癌癥的進展關系密切。LncRNAs在特定的癌癥類型中存在差異表達，運用不同的機制執(zhí)行細胞學功能。因此，lncRNAs是當前癌癥研究的焦點，lncRNAs的功能分析是一個新興的研究領域。在臨床應用方面，了解lncRNAs的功能為我們理解不同癌癥的生物學行為和確定新的治療靶向奠定了基礎，其中包括口腔鱗狀細胞癌。

口腔鱗狀細胞癌 (oral squamous cell carcinoma，OSCC) 是東南亞地區(qū)最常見的惡性腫瘤。在我國，OSCC的發(fā)病率約在3.6/10～8.0/10萬人。在美國，OSCC在每年的致死癌癥中排第八位。OSCC具有很強的侵襲性，常致病人的形態(tài)喪失和功能失調，高達60%的OSCC患者在就診時已處于臨床進展的晚期階段(Ⅲ期，Ⅳ期),OSCC的五年生存率僅為10%～50%[2],因此如何早期檢測和確診OSCC，實現(xiàn)靶向治療是目前研究的熱點。OSCC的發(fā)生發(fā)展是由基因組和表觀基因組的改變共同調控的。但是，相關的機制仍有待闡明。越來越多的證據(jù)表明，lncRNAs的表達失調可能會影響多種癌癥的進展，主要是在表觀遺傳，轉錄和轉錄后多個水平上誘導和促進癌癥的進展，包括口腔癌。因此,lncRNAs有望成為可靠的生物學標志物和抗腫瘤治療的靶點，本文著重對lncRNAs在OSCC中的作用和機制進行綜述，探討其作為診斷依據(jù)，治療靶向和預后指標等潛在的臨床應用，為口腔癌患者提供新的治療策略。

1 長鏈非編碼RNAs的概念和功能機制

在人類基因組中，能編碼蛋白質的基因占總基因的2%左右，其他不編碼蛋白質的序列中，90%以上被轉錄成RNA，這些不具有蛋白質編碼功能的RNA分子統(tǒng)稱為非編碼RNA(non-coding RNAs)。根據(jù)其分子大小，分為兩組。長度<200個核苷酸的RNA分子叫做短鏈非編碼RNAs，如小干擾RNA(small interfering RNAs，siRNAs),PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNAs ，piRNAs)和微小RNA(microRNAs，miRNAs)。近年來，大部分腫瘤的研究都集中在miRNAs；另一組長度>200個核苷酸的RNA分子叫長鏈非編碼RNA(lncRNAs)，多數(shù)由RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成，少數(shù)由RNA聚合酶Ⅲ轉錄形成，存在于核內或細胞漿內[3]。LncRNAs根據(jù)其與對應mRNA的關系通常被分成五種類型：正義lncRNA(sense lncRNA)、反義lncRNA(antisense lncRNA)、雙向lncRNA(bidirectional lncRNA)、基因內lncRNA(intronic lncRNA)、基因間lncRNA(intergenic lncRNA)[4]。LncRNAs曾一度被認為是基因組轉錄產(chǎn)物的噪音，但是近年來， lncRNAs受到的關注越來越多，一些lncRNAs在腫瘤中的作用機制被闡明，依據(jù)研究結果制定的靶向措施也對體內外的惡性細胞起到一定抑制作用，盡管具體角色還有待進一步挖掘，但是可以證實一些lncRNAs可以通過一定的分子機制在多種細胞過程中扮演重要角色，例如細胞生長、分化、凋亡，新陳代謝，腫瘤發(fā)生階段等過程。根據(jù)已經(jīng)研究的lncRNAs，得知lncRNAs調控基因表達的作用機制主要有兩種類型：轉錄調控和轉錄后調控,前者可通過改變染色質結構和直接調節(jié)轉錄因子活性來調節(jié)基因的表達,后者通過調節(jié)mRNA的形成及其翻譯達到對基因轉錄后的調控[5]。

目前的研究表明，lncRNA主要有以下5種功能[6]：(1)由上游非編碼啟動子轉錄的lncRNA可通過抑制RNA聚合酶II募集和/或誘導染色質重構促進或抑制下游基因的表達；(2)反義轉錄本來源的lncRNA能夠與前mRNA雜交并干擾剪接體對剪接位點的識別，從而產(chǎn)生不同的剪接轉錄物。同樣，正義和反義轉錄物的雜交可以由Dicer酶作用產(chǎn)生內源性siRNAs；(3)lncRNA與miRNA的結合可以導致miRNA的功能沉默； (4)lncRNA與特定蛋白質復合物結合可以調節(jié)蛋白質的活性，參與細胞的結構和組織功能，改變蛋白質在細胞中的定位，并影響表觀遺傳調控過程； (5)lncRNAs可以加工成小RNAs?？傊?，lncRNAs可以在轉錄水平，轉錄后水平，表觀遺傳水平等多個方面發(fā)揮作用，調控基因的表達，進而參與機體生長，發(fā)育，遺傳，代謝，衰老和死亡等重要的生命活動以及影響疾病的發(fā)生發(fā)展。

2 LncRNAs在口腔鱗癌中的作用和機制

2.1 MALAT 1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1)

MALAT1是在研究與早期非小細胞肺癌(NSCLC)相關轉錄本的過程中被鑒定出,也是一種與癌癥轉移密切相關的lncRNA，在多種腫瘤類型中均高度表達，主要存在核散斑中[7]，被認為與病人不良愈后和高轉移潛能有緊密關聯(lián)。MALAT1是一種高度保守的lncRNA，位于染色體6p24.3上，長8.7 kb[8]。多個啟動子在MALAT1轉錄中發(fā)揮作用并產(chǎn)生不同的MALAT-1轉錄變異型。 MALAT1因其三螺旋結構而具有獨特穩(wěn)定，因其在核斑點中的定位在RNA代謝中扮演著重要角色。有報道顯示MALAT1在癌組織中的表達是上調的并能調節(jié)細胞周期基因的表達，由于可以調控致癌轉錄因子B-MYB(mybl2)，MALAT1在G1/S和有絲分裂過程中也必不可少。 MALAT1能調節(jié)生長控制基因和對一些基因進行轉錄后調節(jié)，如RNPS1，PRP6和SON，已有報道可通過MALAT1的選擇性剪接而實現(xiàn)[9]?？傊?，這些研究強調MALAT1無論在轉錄和轉錄后水平上都對基因的表達具有一定的調控作用。通過RNA的干擾分子(RNAi)敲除OSCC細胞中的UCA1,MALAT1,HOTAIR,和FOXCUT后發(fā)現(xiàn)能減慢體內外腫瘤的發(fā)展速度，具體表現(xiàn)為抑制細胞增殖，促進凋亡，抑制OSCC細胞的侵襲和轉移。最近Zhou等[10]發(fā)現(xiàn)與正?？谇火つは啾?，MALAT1在OSCC組織中存在過表達。Liang等[11]采用qPCR的方法發(fā)現(xiàn)，MALAT1在TSCC組織比正常組織中表達量高，且與頸部淋巴結轉移有關。在OSCC細胞系(TSCCA和Tca8113)中通過小干擾RNA敲低MALAT1的表達可描述其在維持上皮 - 間質轉化(EMT)，介導細胞遷移和侵襲方面發(fā)揮的作用。在機制上，敲低MALAT1表達能顯著抑制N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達，但在體外實驗中可誘導E-鈣粘蛋白的表達?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)為我們深入了解MALAT1在調控OSCC轉移中的作用及機制提供更好的平臺，表明MALAT1是一個重要的預后因素和治療OSCC的靶向目標。

2.2 MEG3(maternally expressed gene 3)

MEG3是第一個被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制特性的lncRNA。 MEG3在很多正常人體組織中有表達，而在許多癌癥和腫瘤細胞系中表達喪失。腫瘤中MEG3表達喪失可能源于某種基因的缺失，啟動子超甲基化或基因間差異表達的甲基化區(qū)域發(fā)生超甲基化[12]。機制研究表明，MEG3的重新表達能抑制腫瘤細胞的增殖和腫瘤集落的形成，即 MEG3與腫瘤發(fā)生呈負相關。MEG3能降低鼠雙微小體2同系物(MDM2)表達，導致p53的積累，抑制神經(jīng)膠質瘤細胞的生長并誘導p53依賴性和非依賴性形式的細胞凋亡。而且，MEG3的表達在人腦膠質瘤和腦膜瘤組織中顯著降低[13]。

與周圍的非惡性組織比較，lncRNA MEG3的表達在舌鱗狀細胞癌中均顯著降低，可提示OSCC患者的預后不佳[14]。從影響細胞功能方面而言，MEG3在SCC-15和CAL27細胞中的過表達能抑制細胞增殖和細胞周期進程并觸發(fā)細胞凋亡。而且，在宮頸癌中HPV誘導的MEG3下調已被認為是有重要意義的腫瘤發(fā)生機制且它可能在HPV相關的OSCC中發(fā)揮一定作用[15]。這些結果強調了MEG3可作為一種癌癥抑制性的lncRNA，特別是在HPV相關的OSCC中。2017年的一項研究發(fā)現(xiàn)MEG3在OSCC中的表達明顯下降，且CAL27細胞中過表達的MEG3能抑制癌細胞的增殖和轉移，促進細胞的凋亡。重要的，MEG3能通過抑制WNT/β-細胞因子連環(huán)蛋白軸通路起到腫瘤抑制劑的作用。這些研究表明，調節(jié)MEG3有望成為治療OSCC的靶向目標[16]。

2.3 HOTAIR (HOX transcript antisense RNA)

HOTAIR是研究最多的一個典型的反義lncRNA，也是第一個被發(fā)現(xiàn)與腫瘤密切相關的 lncRNA,其在乳腺癌，胰腺癌，大腸癌，肝癌，食管鱗狀細胞癌中都有高表達[17]。它有兩個主要功能區(qū)域[18]：位于RNA 5’端的PRC2結合結構域(polycomb repressive complexes 2,PRC2)和位于3’端的LSD1/CoREST1結合域(lysine specific demethylase 1 complexes， LSD1 )[19]。HOTAIR相當于一個分子支架，在HOXD位點上與組蛋白修飾PRC2復合物和賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(LSD1)/CoREST/REST復合物結合，導致偶聯(lián)的組蛋白H3K27三甲基化和H3K4去甲基化。當HOTAIR過度表達時，PRC2和LSD1增加染色質占據(jù)新的靶點和抑制許多抗轉移基因的轉錄，導致癌癥轉移。重要的是，HOTAIR在多種器官來源的癌組織中存在過度表達的現(xiàn)象，包括胰腺，乳房，結腸和胃腸，且HOTAIR的過度表達與腫瘤轉移和預后不良有密切關聯(lián)。據(jù)有關研究證明HOTAIR是在癌組織中有上調的現(xiàn)象，特別是在頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)中[20]。Wu等[21]在2015年利用實時熒光定量逆轉錄-多聚酶鏈反應(qRT-PCR)的方法分析lncRNA HOTAIR在OSCC組織中及正常組織中的表達，結果表明：與正常組織相比，HOTAIR在OSCC中表達量升高；與無淋巴結轉移的腫瘤相比，HOTAIR在發(fā)生局部轉移的組織中表達量升高。單變量分析顯示HOTAIR表達水平與OSCC 的臨床階段、淋巴結轉移，腫瘤分期和分化程度聯(lián)系密切，HOTAIR高表達的患者愈后較差。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，在體外通過siRNA敲低HOTAIR后，OSCC細胞的增殖和克隆形成受到抑制，OSCC細胞侵襲和轉移能力增強。HOTAIR水平與E-鈣黏著蛋白水平呈明顯負相關，通過將PRC2復合體單元EZH2和組蛋白 H3K27me3與E-鈣黏著蛋白促進子結合來調控E-鈣黏著蛋白的表達，因而推測lncRNA HOTAIR的表達與OSCC的發(fā)生發(fā)展和轉移有密切關系，可能成為預測OSCC生存率的重要標志物。Lu等[22]報道HOTAIR在腫瘤組織中有表達上調的現(xiàn)場，特別是在轉移的組織中，同樣，在轉移性OSCC細胞系中也能觀察到一致的現(xiàn)象。在異種移植模型中，沉默口腔癌干細胞(OCSC)中HOTAIR的表達能顯著抑制其干細胞的特性，侵襲性和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。相反，OSCC中HOTAIR的高表達能增強其轉移潛能和上皮-間充質轉化(EMT)特性。總之，已有的數(shù)據(jù)表明，HOTAIR可以通過調控EMT過程協(xié)調癌細胞的干性和轉移能力，因此HOTAIR可能成為OSCC的治療靶點。

2.4 CCAT1(colon cancerassociated transcript1)

結腸癌相關轉錄物-1(CCAT1)，也被稱為癌相關區(qū)域長鏈非編碼RNA-5(CARLo-5)或CCAT1-S，具有2628個核苷酸的長度，定位于染色體8q24.21上。通過siRNA敲低CCAT1的表達會誘導G1期細胞停滯和增殖抑制。沉默CCAT1的表達會引起E-鈣粘蛋白的上調并隨后下調纖連蛋白和波形蛋白，這是EMT發(fā)生的關鍵標志[23]。最近的一項研究報道，CCAT1在27%(16/60)的口腔腫瘤中存在過表達。過度表達CCAT1的腫瘤顯示高水平的c-Myc并能顯著下調miRNA-155-5p和let7b-5p的水平。 更為重要的是，CCAT1水平高表達的患者顯示出不良的治療效果。CCAT1擴增的樣本主要存在于具有侵襲性表型的腫瘤中且CCAT1表達升高的腫瘤患者中都具有吸煙史。這些結果表明，CCAT1可作為內源性海綿結構導致治療效果不佳。

2.5 FOXC1(fork head box C1 upstream transcript)

FOXC1基因在多種惡性腫瘤中存在高表達，且與腫瘤的發(fā)生進展有功能上的相關性。最近研究表明：許多l(xiāng)ncRNA能與相鄰的編碼基因形成一種功能性的lncRNA-mRNA組合共同發(fā)揮作用。研究人員發(fā)現(xiàn)FOXC1上游的轉錄本(FOXCUT)以及相鄰的FOXC1基因在23例OSCC患者中表達顯著上調，且兩者表達水平呈正相關，即通過siRNA下調FOXCUT的表達時，F(xiàn)OXC1的表達也下降，在OSCC細胞中Tca8113和SCC-9中，F(xiàn)OXC1或FOXCUT的表達下調都能在體外抑制細胞增殖和轉移，且MMP2,MMP7,MMP9的表達也下降。這些證據(jù)表明FOXC1與FOXCUT在lncRNA-mRNA組合高表達的OSCC患者中有一定的研究價值，可能作為一種新型的生物標志物和治療的靶點發(fā)揮作用[24]。

2.6 TUG1

LncRNA?；撬嵘险{基因1(TUG1)在口腔鱗狀細胞癌中也有重要作用。實時熒光定量PCR結果顯示在OSCC組織和細胞系中，TUG1表達上調。高表達的TUG1與腫瘤的TNM分期、OSCC患者的淋巴結轉移和腫瘤分級顯著相關。CCK-8法、MTT法、克隆形成實驗、細胞侵襲實驗通過轉染siRNA敲除TUG1后抑制細胞的生長和細胞增殖，侵襲。在Tca8113及TSCCA轉染TUG1 siRNA能誘導細胞凋亡。總之，敲除TUG1能抑制禁止細胞生長、增殖和侵襲，且通過靶向Wnt /β-catenin信號通路誘導OSCC細胞的凋亡?，F(xiàn)有的數(shù)據(jù)表明，敲除TUG1可能作為一種治療口腔鱗癌的新型靶點[25]。

2.7 LincRNA-ROR (long intronic noncoding RNA ROR)

Linc-ROR是位于18q21.31上，長度為2.6 kb的 lncRNA，由豐富的反轉錄轉座子元件元素組成，如LINE，SINE和LTR等。LincRNA作為競爭性內源性RNA發(fā)揮作用，并通過在轉錄水平上擴增miRNA-145從根本上影響人胚胎干細胞的分化[26]。與linc-ROR相關的轉錄因子在多種腫瘤中存在表達，并與未分化的表型相關。長的非編碼RNA的表達譜揭示linc-RoR可作為口腔癌預后的生物標志物[27]。Linc-ROR是一種程序重編的調控者，與腫瘤發(fā)生有關，在未分化的腫瘤中過度表達且與腫瘤復發(fā)和治療效果不良有密切關系。通過其對miRNA-145-5p的海綿效應，linc-ROR能對其靶基因c-Myc，Kl，Sox2和Oct4進行轉錄后控制，這有助于形成和維持未分化狀態(tài)。這項研究表明Linc-ROR的過表達與未分化的口腔腫瘤有關且監(jiān)測Linc-ROR對臨床治療效果有一定的預測意義。

2.8 LncRNA AC132217.4

越來越多的證據(jù)表明，為了發(fā)生轉移，癌細胞必須經(jīng)常改變其lncRNA表達譜以調節(jié)許多生物過程[28]，例如通過EMT或是由TGFb信號誘導的各種信號傳導途徑[29]。在OSCC中，已有少數(shù)lncRNAs被報道參與細胞轉移，為了鑒定影響OSCC細胞轉移的新型lncRNA，Li X等[30]人通過尾靜脈注射裸鼠建立了高轉移性細胞系UMSCC6H。通過實驗我們發(fā)現(xiàn)， LncRNA AC132217.4在UM-SCC6H細胞中增加并可以促進細胞遷移和EMT。LncRNAs在染色質組織中，轉錄或轉錄后水平上都能調節(jié)基因的表達。 AC132217.4通過在轉錄后水平上增強其mRNA的穩(wěn)定性來促進IGF2的表達。研究數(shù)據(jù)表明，AC132217.4與IGF2 mRNA的30UTR結合，抑制其轉換，并且它可以直接結合IGF2 mRNA的3′UTR并增加其穩(wěn)定性，導致IGF2的水平增加。此后，我們發(fā)現(xiàn)KLF8與AC132217.4的上游序列可以發(fā)生結合，進而在轉錄水平上激活其表達，其通過AC132217.4-IGF2軸在體外和體內加速OSCC的轉移。因此，上述數(shù)據(jù)表明KLF8-AC132217.4-IGF2信號通路在OSCC轉移中起關鍵作用。

2.9 口腔鱗癌中的其他lncRNAs

PDIA3P1是一種大小為2099 bp的lncRNA，位于染色體1q21.1處。Zhang等[31]已經(jīng)報道PDIA3P1在OSCC中存在過表達，但是PDIA3P 的表達水平與OSCC之間的關系并沒有闡述。Sun等[32]在2017年對PDIA3P1的作用機制進行更深一步研究。qRT-PCR的結果顯示，PDIA3P1在OSCC中存在高表達并能降低OSCC患者的生存率。CCK-8和克隆集落形成實驗被用來檢測PDIA3P的表達對細胞增殖的影響。通過轉染siRNA沉默PDIA3P的表達可以抑制OSCC細胞的增殖，抑制腫瘤生長，減少增殖抗原Ki-67在體內的表達，負向調控miR-185-5p在OSCC細胞中的表達。因此PDIA3P可以作為OSCC治療的靶向目標。Guo Y等[33]在2017年發(fā)現(xiàn)，lncRNA CEBPA-AS1與口腔鱗癌的不良預后有關聯(lián)，且能通過CEBPA / Bcl2信號通路促進癌癥的發(fā)生。CEBPA-AS1定位于細胞質與核周圍的區(qū)域，可充當OSCC中表達上調的潛在致癌基因，與腫瘤的低分化，淋巴結轉移及高臨床分期有關，被認為是口腔鱗癌患者預后的重要生物標志物。沉默其表達能抑制OSCC細胞增殖，誘導細胞凋亡，遷移和侵襲，這一作用效果是由靶向CEBPA和通過CEBPA / Bcl2通路實現(xiàn)的。通過實時熒光定量PCR結果顯示，lncRNA ferritin heavy chain 1 pseudogene 3(FTH1P3) 在口腔鱗狀細胞癌中的表達上調，可以降低口腔鱗狀細胞癌患者的生存率。FTH1P3異位表達能促進口腔鱗狀細胞癌細胞增殖與集落形成。此外，F(xiàn)TH1P3作為競爭的內源性RNA(開辟)，有效地成為mir-224-5p的海綿結構從而調節(jié)表達fizzled 5的表達。數(shù)據(jù)證實FTH1P3可以作為mir-224-5p的分子海綿調節(jié)fizzled 5的表達從而促進口腔鱗狀細胞癌的進展[34]。Long intergenic non-coding RNA 00152 (LINC00152)長基因間非編碼RNA 00152(LINC00152)是定位在染色體2p11.2上，轉錄長度為828個核苷酸的一種lncRNA。最近的研究表明胃癌中LINC00152的表達增加，且這種lncRNA在胃癌中發(fā)揮重要作用[35]。Yu J等[36]等從舌組織中獲取的原發(fā)性口腔鱗狀細胞癌樣本中發(fā)現(xiàn)LINC00152也存在高度表達的現(xiàn)象且腫瘤中LINC00152的高水平與癌癥進展、分化程度、癌癥復發(fā)和侵襲有顯著相關性。Kaplan Meier生存分析顯示，口腔癌患者中LINC00152水平升高與總體生存率差之間存在顯著相關性。這些發(fā)現(xiàn)表明LINC00152可能成為TSCC早期檢測和預后評估的潛在生物標志物。

3 展 望

揭示癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機制可能有利于尋求更有效的策略來及早監(jiān)測、診斷、判斷愈后療效。OSCC的發(fā)生發(fā)展是由多步驟多因素構成的極其復雜的生物學過程，該過程涉及遺傳學，表觀遺傳學的進行性獲得以及基因組的動態(tài)變化[37]?？谇击[癌相關的lncRNAs可以在轉錄水平，轉錄后水平，表觀遺傳水平等多個方面發(fā)揮作用，通過調控基因表達、調節(jié)蛋白活性等方式參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。lncRNAs在腫瘤發(fā)生，轉移，發(fā)展中的角色還有待進一步挖掘，但我們可以展望，隨著芯片技術及高通量測序檢測技術的運用，lncRNAs將會為腫瘤治療開辟新的應用前景。